朊病毒病中Tau蛋白异构体分布和磷酸化特点的研究

Tau protein is a kind of microtubule associated protein and plays an important role in the development of neurodegenerative diseases. In order to explore the role of different tau isoforms in the pathogenesis mechanism of the prion disease, two scientific problems in the fields of tau isoforms profiling and phosphorylation in the prion-infected brain tissue and secretion difference in the internal and external of prion-infected nerve cell are planned to be systematically analyzed from the time-points of prion penetration, from the levels of prion-infected brain tissue and cell, using methodologies of the molecular and cellular biology with the tools of animal experimental science. Three major research components are designed, including (1) the varying pattern of tau isoforms in the prion penetration using prion-infected brain tissue; (2) the levels and differences of phosphorylation of tau isoforms in the prion-infected brain tissue; (3) the distinction of secretion ability in the internal and external of prion-infected nerve cell. Though those systematical studies from various points of views, the characteristics of profiling and phosphorylation of tau isoforms in prion disease are expected to be clarified.

Tau蛋白是一组微管相关蛋白，在神经退行性疾病的发生、发展中发挥了重要作用。为了更好地探明tau蛋白不同异构体在朊病毒病致病机制中的作用，本项目拟围绕tau蛋白异构体在朊病毒病脑组织中的分布和磷酸化特点及朊病毒感染神经细胞内外分布差异两个科学问题，采用分子/细胞生物学与传统实验动物学相结合的技术手段、从脑组织实验和细胞实验两个层面，从朊病毒感染的不同时间节点，系统开展（1）朊病毒感染脑组织中tau蛋白异构体随感染潜伏期变化规律的研究；（2）朊病毒感染脑组织中tau蛋白异构体磷酸化水平和差异的研究；（3）tau蛋白异构体在朊病毒感染神经细胞内外分泌能力差异的研究，进而系统地了解和明确tau蛋白异构体在朊病毒病中的分布和磷酸化特点。

研究显示许多神经退行性疾病脑组织中都存在tau蛋白的聚集。由于缺乏tau外显子特异性抗体，故病理条件下各种tau异构体的分布还不清楚。基于此，我们制备了识别人tau蛋白外显子2和10的特异性单克隆抗体（4A8和3E12），该制备的抗体能够识别多种哺乳动物脑组织中含有相应外显子的异构体。通过Western blot证实我们制备的这两种单克隆抗体不仅能够识别重组GST融合的tau外显子蛋白，还能够识别不同重组的tau蛋白异构体。同时，Western blot和免疫共沉淀实验结果显示制备的两种单克隆抗体不仅可以识别人脑组织中的内源性tau蛋白，还能够识别多种哺乳动物如山羊、牛、家兔、仓鼠和小鼠脑组织中内源性的tau蛋白。. 我们利用制备的两株单抗4A8和3E12进行生物素标记并且建立了直接ELISA方法。通过建立的ELISA方法对朊病毒病患者脑脊液中含有两种外显子（外显子2和10）的tau异构体含量进行检测。结果发现sCJD患者脑脊液中含有外显子10（即含有四个微管重复序列）的tau异构体含量明显升高。通过未标记的两株单抗4A8和3E12及商品化总tau检测试剂盒，我们建立了竞争ELISA方法，发现绝大多数升高的tau蛋白都含有外显子2和10。这种tau蛋白异构体的特异性增加还见于gCJD（T188K和E200K）患者脑脊液中，但是在FFI患者的脑脊液中则没有这种特异性地增加，通过对sCJD患者脑脊液检测发现增加的tau蛋白异构体与脑脊液中出现14-3-3成正相关。这种相似的现象同样在朊病毒感染啮齿类动物模型及一例sCJD患者脑组织中发现。我们证实了在某些类型朊病毒感染的患者脑脊液中特异性tau蛋白的增加，为下一步理解各种tau蛋白在朊病毒病中的生理代谢及可能参与致病的意义研究奠定了基础。. 目前，本课题研究成果已发表中英论文10篇，在SCI收录的国际期刊上发表论文7篇，其中2篇IF>5。参与培养硕士研究生3名。. 本课题从发病机理、应用基础、科研论文及研究生培养方面均完成了预期目标，同时增加了许多计划外研究内容，大大扩展了本项目的研究意义。