新型无酶核酸线路与等温扩增偶联用于POC兼容的超特异基因诊断

A series of isothermal nucleic acid amplification reactions are considered as the most promising techniques that can lead to point-of-care (POC) gene diagnosis. However, their real applications in clinical departments or POC fields have been badly delayed by lacking of sequence-specific downstream signaling methods. In this project, we propose to use strand exchange based nucleic acid amplification circuit as an ultra-specific and smart bridge between isothermal amplifications and final readouts. By using nucleic acid amplification circuit to probe loop mediated isothermal nucleic acid amplifications, the “false signal” frequently raised by traditional detection methods will be eliminated, and an ultra-sensitive and ultra-specific universal diagnosis platform will be established for widely concerned diseases. Both real-time florescence and commercial glucometer will be adapted as final readouts, which will finally demonstrate the promising potential for real applications of such LAMP-circuit system in lab, clinic, and even POC. The model target will start from gene of Ebola virus and be generalized to other widely concerned diseases.

在恒温下既可实现超灵敏核酸检测的等温核酸扩增是基因诊断学中最有望实现便携式定点护理诊断（POC）的技术手段。但其从实验室到医疗诊断部门，甚至到POC的真正转化却一直受限于 “缺乏特异性信号传导平台”这一瓶颈。本项目拟利用基于核酸链交换反应的核酸分子循环线路作为等温核酸扩增和信号输出之间的特异性枢纽。通过环介导等温扩增（LAMP）与核酸分子循环线路的高效偶联建立起针对致病基因的超灵敏、超特异“普适型”分子识别和信号传导平台，最大程度的消除“假像”信号；并采用实时荧光和血糖仪读数两种信号表征方式证明该偶联方法直接用于实验室和医疗单位的可能性，以及用于实现POC诊断的巨大潜力。具体模型分析对象将首先采用目前最受关注的埃博拉病毒基因，随即推广到其他重大疾病相关的基因检测上。

在恒温下既可实现超灵敏核酸检测的等温核酸扩增是基因诊断学中最有望实现便携式定点护理诊断（POC）的技术手段。但其从实验室到医疗诊断部门，甚至到POC的真正转化却一直受限于“缺乏特异性信号传导平台”这一瓶颈。为有效解决这一问题，本项目创新建立“恒温扩增-核酸分子线路”联用技术，简称LAMP-CHA。具体通过将环介导等温扩增（LAMP）的催化反应产物直接或间接设计为CHA催化剂，使“酶扩增的超级放大”与“无酶CHA的智能特异”高效融合，从而成功弥补其各自在序列选择性和灵敏度上的重大缺陷，最终建立起针对致病基因的超灵敏、超特异分子识别和信号传导新方法。该方法可灵活采用实时荧光、电化学，乃至商品化血糖仪等多种传统和便携性信号表征方式进行信号输出，对多种致病微生物，如埃博拉,中东呼吸综合症,阪崎肠杆菌和出血性大肠杆菌(malB)等特征基因的检测限低至20分子拷贝，相当于10-18 mol/L分子浓度，在满足临床检测要求的同时颇具POC转化潜力。除此之外，本项目还创新设计“发卡型”、“三通组合”和“四通组合”三种各具优势的“万能传导”探针，将任意序列的核酸片段LAMP产物转至同一套性能优良的CHA反应，进而首次实现了单通道，单试管内的多元和逻辑分析体系。这一系列创新进一步提升了LAMP-CHA联用技术的成功率、普适性和便携性。.基于上述研究进展，本项目执行期内共发表SCI论文7篇，申请专利1项，培养博士研究生3名，其中毕业1名。以本项目研究主题相关的“基于核酸等温扩增和核酸分子放大线路联用技术的基因快检试剂盒”项目获2017“中科创客”创业创新大赛决赛一等奖。目前，我们已经在分子层面，建立完全有望灵活满足各种临床需求的基因检测新原理。已与广州迪奥生物科技有限公司，哈尔滨赛恩斯生物科技有限公司等多家企事业单位建立合作意向，共同推进结核分枝杆菌和肠道病菌相关基因检测试剂盒的开发和技术转移。未来，我们期望能为此项技术配备更为便携性的信号输出和一体化装置，推进基因即时诊断的早日到来。