hTERT基因修饰建立永生化脊索细胞系及其应用潜能研究

Notochordal cell（NC） is the precursor cell of nucleus pulposus. In the development of most vertebrate, the disappearance of NC in the nucleus pulposus is often coincident with the start of intervertebral disc degeneration. It has been proved that NC not only acts as the precursor cell of nucleus pulposus, but also as an "organizer cell" for the regulation of the surrounding cells. Thus, NC plays important rolls in the maintenance of the intervertebral disc health. However, human NC in the nucleus pulposus disappears before puberty. Moreover, NC is not very proliferative in vitro culture, and there has been no effective way for its amplification in vitro. Therefore, the research on NC was limited greatly. The ectopic expression of human telomerase reverse transcriptase (hTERT) allowed the immortalization of many human cell lines. Cells immortalized by hTERT could largly maintain the physiological function of normal cells. In recent years, our team has successfully taken the lead in immortalizing human nucleus pulposus cells(NPC) by rAAV-TERT infection. In this study, for the first time, we are going to immortalize NC by rAAV-TERT infection to realize the amplification of notochordal cells. Then we culture the amplified cells on the basement membrane extract (BME) gel substrates to regain the phenotype of normal NC. By coculture technique, we are going to further explore the regulatory effects of hTERT immortalized NC on NPC. At last,we are going to repair the degenerated disc model by transplanting hTERT immortalized NC cells. Thus, we can comprehensively evaluate the potential of hTERT immortalized NC in the therapy of degenerative disc disease.

脊索细胞是髓核的前体细胞，在脊椎动物的发育过程中，髓核内脊索细胞的消失往往伴随着椎间盘退变的开始。研究表明脊索细胞不但自身具有髓核前体细胞的功能，还作为"组织者"细胞调控周围细胞的生长及功能，从而在维系椎间盘内环境稳定方面发挥重要作用。然而人类脊索细胞在10岁前即已消失，且脊索细胞体外扩增极为困难，严重限制了对其深入研究及应用。外源性表达人端粒酶逆转录酶（hTERT）基因可使多数体细胞发生永生化。本课题组近年率先应用hTERT基因构建了永生化人髓核细胞系，发现该方法可有效延缓髓核细胞衰老，同时可维持髓核细胞正常功能且无致瘤性。本项目拟进一步应用hTERT基因建立永生化脊索细胞系，首次实现脊索细胞的体外扩增，进而用基底膜凝胶基质培养环境促进脊索细胞表型恢复，通过共培养实验进一步研究永生化脊索细胞对髓核细胞增殖及蛋白表达的影响，最后通过犬椎间盘退变体内修复实验综合评估永生化脊索细胞的应用潜能。

背景. 椎间盘退变生物治疗的一个关键问题是确立合适的种子细胞来源。众多关于髓核细胞（NPC）以及各种组织来源的间充质干细胞的研究显示了一定的应用潜能，然而其各自都存在难以克服的缺点。近年来很多学者将目光转向髓核细胞的前体—脊索细胞（NC）。尽管众多研究提示NC用作椎间盘生物治疗有着巨大潜能，然而，NC体外分离培养困难，增殖极为缓慢，在培养过程中表型迅速丧失，这使得众多关于NC的研究无法深入，严重限制了其应用价值。.主要研究内容. 本项目在成功分离纯化椎间盘脊索细胞的基础上，尝试通过外源性hTERT基因修饰建立永生化NC系，从而实现NC的体外扩增；通过基底膜凝胶基质表面培养，探索促使NC恢复表型的体外条件；通过对富含脊索细胞的髓核组织（NRNP）的不同消化程度研究，探索将其应用于促进人NPC生长及表型恢复的最佳条件；最后通过椎间盘退变修复实验综合评估NC在椎间盘退变生物治疗领域的应用潜能。.重要结果及意义. 研究结果表明，通过序贯酶消化、梯度滤网及密度梯度离心方法可获得纯度大于95%的脊索细胞；脊索细胞消化后增殖极为缓慢，长期培养后出现细胞死亡及形态改变。行rAAV-hTERT 感染后生长状态进一步下降，无法实现体外大量扩增。基底膜凝胶基质表面培养可有效改善NC在体外培养过程中的生长状态，同时降低NC的表型丧失。不同消化程度NRNP在体外培养过程中，2小时部分消化组在细胞活性以及表型方面表现均明显优于天然髓核组及完全消化组；部分消化NRNP对人NPC的生长、增殖、表型维持及细胞分化均具有正性调节作用，同时可降低NPC细胞死亡率，延缓细胞衰老，为将其用于组织工程的深入研究提供了重要依据。直立体位下无创性轴向加载方式可显著加速兔腰椎间盘的退变进程，更好的模拟了人类椎间盘退变进程，表现为髓核含水量降低，I型胶原表达升高，而II性胶原及蛋白多糖降低；髓核组织内大量纤维软骨样组织长入，纤维环增厚，而髓核区域较对照组变小；该动物模型的成功建立为后续椎间盘退变修复实验的深入研究奠定了基础。