分泌蛋白Canopy2在缺血再灌注损伤心肌细胞caspase8凋亡通路中的作用

Reducing the apoptosis of cardiomyocytes induced by myocardial ischemia and reperfusion (IR) is a main challenge in the therapy of acute myocardial infarction. Canopy2 is a novel secreted protein. Our new exciting preliminary studies demonstrate that after IR injury (IRI), the levels of Canopy2 increase after the acute inflammatory phase in the process of IRI. Moreover Canopy2 can inhibit the cellular apoptosis by downregulating caspase8. It is known that the transcription factors STAT1 and STAT5a bind to the promoter region of Canopy2 gene. Therefore we hypothesize that STAT1/5a regulate Canopy2 biosynthesis, that may further be involved in the myocardial repair by modulating caspase8 mediated apoptosis. To study these pathways, we will perform Western blot，RT-PCR，TUNEL, flowcytometry, ChIP, CoIP, MS ,et al, to explore the STATs-CNPY2-caspase8 pathway of apoptosis. After that, the values of Canopy2 after myocardial IR will be performed by Canopy2 gene therapy in the ischemic myocardium, which will be exercised by ultrasound-targeted microbubble delivery. The study would provide a novel target of medicine for modulating the cardiomyocyte apoptosis induced by IRI.

减少心肌细胞凋亡是急性心肌梗死再灌注治疗的一大难题。Canopy2是一种新型分泌蛋白。最近研究发现：心肌Canopy2在缺血再灌注损伤（ischemia/reperfusion injury，IRI）炎症期后明显升高，Canopy2可通过下调caspase8抑制细胞凋亡，而IRI中活化的转录因子STAT1和5a可结合于Canopy2基因启动子区。提示：受STAT1/5a调控的Canopy2可通过抑制caspase8凋亡通路参与IRI心肌修复。本项目采用WB、RT-PCR、TUNEL、流式细胞计数、ChIP、CoIP、MS等方法，在心肌细胞水平探索STATs-Canopy2-caspase8凋亡通路对IRI修复的贡献；采用超声靶向微泡破碎技术的Canopy2基因治疗，开展Canopy2修复IRI的探索性治疗。本项目的深入研究为临床治疗IRI引发的心肌细胞凋亡寻找一种新的药物干预靶点。

本项目旨在揭示心肌缺血再灌注（IR）损伤心肌细胞凋亡的分子机制，为临床治疗提供新的研究方向和药物开发靶点，涉及动物、细胞水平，运用常规分子生物学方法及IR心肌Canopy2基因治疗（过表达腺病毒载体心肌注射），研究包括明确Canopy2是否抗IR心肌细胞凋亡、缺血再灌注Canopy2基因治疗（过表达腺病毒载体心肌注射）改善心肌缺血再灌注损伤的预后评估、心肌细胞CNPY2调控机制和Canopy2抗心肌细胞凋亡的信号通路机制探索。.结果显示心肌细胞是心肌CNPY2的主要来源，呈胞浆分布。在梗死及边缘区，IR后1周CNPY2水平显著低于伪手术组，其后逐渐升高；在远段非梗死区，IR后CNPY2呈现持续升高趋势。缺血即刻给予Canopy2基因治疗，能够明显减低再灌注4天心肌凋亡（TUNEL染色和westerblotting检测PARP蛋白激活），再灌注28天梗死面积显著减低、心功能明显改善。在H9c2心肌细胞，H2O2诱导，表明CNPY2抗细胞凋亡性死亡（流式细胞计数AnnexinV和PI双染细胞、Hoechst33258染色及PARP蛋白激活情况检测）、增加细胞活力（CCK8检测）。此外，H2O2处理引起细胞CNPY2水平增加，这种增加能够被NFκB通路抑制剂Parthenolide预处理抑制；另一方面，Parthenolide预处理阻断了过表达Canopy2的抗细胞凋亡作用。. 这些结果充分表明CNPY2抗心肌细胞凋亡作用，并且与NFκB通路的激活密切相关，但其中涉及的详细分子机制尚不清楚。目前正在进行进一步工作，探究NFκB通路抑制导致CNPY2水平下降是否是由于NFκB通路调控Canopy2基因转录，以及CNPY2如何反馈调节NFκB通路，从而影响IR诱发的心肌细胞凋亡。.除此以外，参与了一些其他的IR心肌损伤修复研究，涉及炎症、信号通路、心衰。. 本项目研究提示很可能存在一条全新的围绕NFκB-Canopy2基因及蛋白CNPY2的抗缺血再灌注心肌细胞凋亡的通路。研究一方面发现、补充了NFκB通路抗心肌细胞凋亡的下游保护性效应分子，另一方面预示了一种NFκB通路调控的新机制。. 在项目参与下，目前发表科研文章3篇（SCI收录，总计被引8次），指导博士研究生1名（已毕业），硕士研究生2名（在读）。