禽流感病毒NS1蛋白与跨种动物TRIM25的相互作用及其效应

Avian Influenza Virus (AIV) not only infect avian but also can adapt to mammalian animals, such as human and mouse by crossing the species barrier. According this AIV was considered to post a potential threat to the safe of animal husbandry and human public health. Previously the TRIM25 ubiquitin E3 ligase-mediated Lys63-linked ubiquitination of the viral RNA sensor RIG-I was required for its optimal downstream signaling. The NS1 protein was found partly blocking the TRIM25 and affected the ubiquitination of RIG-I. However, the mechanism of mammalian animal TRIM25 and RIG-I interact with AIV NS1 is still needed to be further verified. In this study, Co-IP will be enrolled to verify the proteins interaction between virus and mammalian animal TRIM25 and RIG-I. The key amino acid sties on protein interaction will be analyzed and found by bioinformation software. Further function verification of the key sites in vitro and in vivo will be conducted after generate the NS1 direct mutants AIV H9N2 and human H1N1 strains through reverse genetic. In expectation, the molecular inter-reaction mechanism of AIV NS1 and mammalian animal TRIM25 and RIG-I can be clarified in this study and a further contribution will be provided for reducing the risk on public health.

禽流感病毒（Avian Influenza Virus, AIV）跨种传播对畜牧业和公共卫生安全已构成严重威胁。已知宿主RIG-I在上游TRIM25泛素化连接酶作用下，对机体抗流感病毒感染起重要作用。流感病毒NS1蛋白通过结合TRIM25抑制RIG-I通路的抗病毒效应。但AIV NS1与跨种动物TRIM25互作的具体机制及其效应尚不清晰。本题拟通过免疫共沉淀试验研究 AIV以及H1N1人流感病毒NS1蛋白与人、小鼠TRIM25结合能力；然后明确关键互作氨基酸位点；利用定向突变和反向遗传技术构建禽H9N2和人H1N1的NS1突变株，在人、小鼠细胞和小鼠活体上验证突变病毒各位点与TRIM25互作效应；最终明确AIV与跨种动物RIG-I互作的分子机制。成果将为针对流感病毒跨种间传播研制特异药物、疫苗，进一步探究易感动物RIG-I及其下游蛋白抗感染潜能，提供重要依据。

流感病毒可感染禽类和多种哺乳类动物，而天然免疫是宿主抵抗流感病毒感染重要屏障。维甲酸诱导基因I（retinoic acid-inducible gene I，RIG-I）通路是动物抗流感病毒天然免疫反应重要途径。在RIG-I识别流感病毒RNA并诱导机体产生抗病毒免疫反应过程中，三结构域蛋白25（tripartite motif 25，TRIM25）E3泛素连接酶，可对RIG-I氮端两个帽状结构域（caspase recruitment domains，CARDs）进行泛素化。CARDs被泛素化后，RIG-I可进一步结合通路下游蛋白，最终诱导机体分泌I型干扰素发挥抗病毒效应。流感病毒非结构蛋白（Nonstructural protein 1, NS1）已被证实在感染过程中能与宿主TRIM25发生相互作用，抑制TRIM25参与RIG-I泛素化，从而抑制RIG-I通路活化及下游干扰素产生。但不同种属动物的TRIM25和RIG-I间存在差异，流感病毒NS1蛋白与哺乳动物或禽TRIM25、RIG-I互作机制也尚不明晰。因此，本课题着重研究流感病毒NS1蛋白和病毒聚合酶亚基蛋白等非结构蛋白与不同种属动物TRIM25及RIG-I的互作效应。研究发现流感病毒 NS1蛋白与不同种属动物宿主（人、鼠、鸡）TRIM25的互作效率存在差异，尤其与小鼠TRIM25结合效率最低，而这种低效互作与不同种属动物TRIM25功能域结构有关。进一步研究流感病毒NS1蛋白对RIG-I泛素化的影响，发现在鼠细胞中，NS1蛋白无需通过抑制TRIM25来影响RIG-I泛素化。那除了NS1蛋白外，流感病毒其它蛋白是否也参与宿主RIG-I互作呢？于是进一步研究H9N2禽流感病毒聚合酶蛋白与哺乳类动物宿主RIG-I的互作效应，研究发现H9N2 禽流感病毒聚合酶亚基PB2、PB1和PA与三种动物的RIG-I均可发生结合，而且这种结合不需要RNA介入即可形成。但是，三种H9N2 禽流感病毒聚合酶亚基与RIG-I结合对下游干扰素生成的影响却不明显。聚合酶亚基与RIG-I结合作用对于病毒在跨种间传播过程中起到的作用仍有待进一研究。本研究，为了解流感病毒蛋白与哺乳类动物RIG-I及其相关因子TRIM25的互作效应，为解释流感病毒与宿主免疫通路关键蛋白互作机制机制提供支撑，为解释流感病毒跨种间传播提供参考数据。