CXCL12/CXCR4生物轴促进肾细胞癌转移的核内调控机制研究

Renal cell carcinoma (RCC) is the common cancer of urinary system, and the effective treatment for metastatic RCC is lack. Many evidences showed that CXCL12/CXCR4 biological axis was related to tumor metastasis. In our previous study, we found that CXCR4 was in connection with metastasis of RCC and transferred to nucleus with the chemotaxis of CXCL12. We speculate that CXCR4 nuclear localization may enhanced invasion and metastasis of tumor cell by interacting with nuclear protein and/or acting as a transcription factor. We have identified preliminarily that CXCR4 combined with nuclear protein NR1D2 and c-Src as well as DNA. In order to disclose the mechanism of the pathway, we will utilize some technologies, such as immunofluorescence, Chip, RNAi and so on, through subcellular localization, detection of cell biological functions and gene high-throughput screening, to investigate the mechanism between CXCR4 and nucleoprotein, and discover potential transcription factor binding sites and downstream target genes. The aim of our study is to clarify the intra-nuclear mechanism of CXCL12/CXCR4 biological axis mediating RCC metastasis, which will provide a new strategy for treatment of metastatic RCC.

肾癌是泌尿系统常见肿瘤，转移性肾癌目前尚无有效治疗方法。大量证据表明CXCL12/CXCR4生物轴与肿瘤转移有关。我们前期研究发现CXCR4表达与肾癌转移密切相关，并在CXCL12趋化作用下出现入核现象。我们推测：CXCR4入核后可能与某些核蛋白相互作用和/或作为转录因子激活下游基因，从而增强肾癌细胞转移能力。我们已初步明确CXCR4与核内蛋白（NR1D2、c-Scr）以及DNA相结合。为深入揭示CXCR4核内作用的确切机制，本课题将采用免疫荧光、免疫共沉淀、RNA干扰等技术，通过亚细胞定位、细胞生物学功能检测、基因高通量筛选等方法，进一步探讨CXCR4与核蛋白NR1D2、c-Scr间的作用机理，寻找可能存在的转录因子结合位点和靶基因，阐明CXCR4核内信号传导通路。本课题拟揭示CXCL12/CXCR4生物轴介导肾癌转移的核内机制，为制定转移性肾癌治疗新策略提供思路。

肾癌是泌尿系统常见肿瘤，转移性肾癌目前尚无有效治疗方法。大量证据表明CXCL12/CXCR4 生物轴与肿瘤转移有关。我们前期研究发现CXCR4 表达与肾癌转移密切相关，并在CXCL12 趋化作用下出现入核现象。在此基础上，我们通过进一步研究：（1）鉴定证实了CXCR4蛋白的核定位序列位于氨基酸序列的第146位开始的RPRK，改变核定位序列中任一位碱性氯基酸均导致CXCR4蛋白的核定位能力丧失。（2）构建了CXCR4核定位序列突变的异构体，并构建了稳定过表达CXCR4核定位突变序列的肾癌细胞系rescue模型，并以此为基础验证了CXCR4核定位的生物学功能：CXCR4 核定位缺失后增殖、侵袭、单克隆形成、裸鼠皮下成瘤能力能力明显下降。（3）CXCL12、NMIIA、Hif-1a参与CXCR4入核的过程。免疫共沉淀后采用质谱分析法获得CXCR4可能的结合蛋白，经后期验证CXCL12、NMIIA、Hif-1a与CXCR4相互结合，并有可能参与其入核过程。（4）CXCL12 和肾癌细胞的CXCR4 结合后促进了CXCR4 蛋白的核转位，CXCL12 在和CXCR4 结合后可能形成复合体进入细胞浆，CXCL12未在细胞核内表达。HIF-1alpha在细胞浆内和CXCR4 相互作用，可能参与了CXCR4 的核定位；HIF-1 alpha 作为CXCR4 入核过程中的重要靶点蛋白和CXCR4 结合，是缺氧环境下促进肾癌细胞CXCR4 核定位的重要机制；CXCL12 刺激肾癌细胞后，HIF-1 alpha和CXCR4 相互作用，进入细胞核内，可能通过EMT 信号通路导致肾癌转移。在肾癌转移的EMT 通路中，CXCL12/HIF-1alpha/CXCR4通路具有重要作用，并在肾癌原发灶和转移灶中得到证实。（5）NMⅡA影响CXCR4蛋白亚细胞分布，通过抑制 NMⅡA可增加后者在细胞膜表达量，减少其细胞核内表达。CXCR4蛋白的亚细胞分布状态影响肾癌细胞的侵袭和转移能力。（6）在临床样本中验证CXCR4核定位与通路相关蛋白的关系，发现HIF-1 alpha、CXCL12、CXCR4核定位均与预后相关；多因素分析提示此相关指标可以作为肾癌预后的预测指标。本研究进一步阐明了CXCL12/CXCR4生物轴介导肾癌转移的核内机制，同时为肾癌的预后预测、早期干预、靶向治疗提供了新思路。