胀果甘草活性多糖的免疫识别受体及构效关系的研究

Glycyrrhiza inflata Bat. is a famous medicinal resource with the reginal characteristics in Xinjiang. The immunopoteniating effect has been associated with its polysaccharides functions( GiPs) in our previous study. We have already purified 13 homogeneous polysaccharides from the materials and elucidated their chemical structures with the chemical methods and spectral analysis. We also have testified the crude GiPs and its purified fractions had remarkable immunostimulating activities. Meanwhile, there are little research on the immunoregulation target cells and receptors. Based on our previous study, we will select GiP-B1, a purified homogeneous polysaccharide with the most effective mmunostimulating activity among GiPs, as the study subject. Firstly, we will study its effects on the proliferation and activation of T、B lymphocytes and macrophages and identify the immune target cells. Secondly, we will screen TLR4, TLR2, CD19 and CR3 as the potential polysaccharide immune receptors on B cells and macrophages membrane with the antibody block method, and then take the gene mutant mice as the research target to verify the binding site by 3H-TdR incorporation test, ELISA and biolayer interferometry. Furthermore, we will study the signal pathway of its immunoactivation. In the study of the structure-activity relationship of GiP-B1, we will apply the method of the partial acid hydrolysis and the controlled degradation with specific tool enzyme and obtain the oligosaccharides with different polymerization degree, and then test their immunoregulation activities and analysis the active functional unit of GiP-B1. The results of this project will elucidate the immune mechanism of the active polysaccharide GiP-B1 in the receptor molecular level.

胀果甘草是新疆具有区域特色的中药资源，其多糖已被证实是一类重要的免疫调节剂。本项目拟在前期工作基础上，以胀果甘草中分离纯化的一个免疫活性多糖GiP-B1为研究对象，观察其对T、B淋巴细胞和巨噬细胞活化和增殖功能的影响，确认该活性多糖免疫调节作用的靶细胞；在此基础上，拟从CD19、TLR4、TLR2和 CR3等已知多糖受体为切入点，应用模式识别受体的单克隆抗体与多糖免疫细胞膜表面已知受体进行竞争性抑制，采用抗体封闭法筛选和鉴别GiP-B1在靶细胞上可能的受体，并初步研究GiP-B1激活免疫细胞的信号通路：同时采用部分水解或特异工具酶控制酶解的方法获得不同寡糖片段，检测其免疫活性并研究它们与免疫细胞的结合，确定在多糖-受体作用过程中参与作用的多糖结构区域或"活性结构单元"，阐明胀果甘草多糖的结构与免疫活性之间的效应关系。本研究将在受体分子水平上阐明胀果甘草多糖免疫调节作用的分子机制。

胀果甘草多糖GiP已被证实具有免疫调节作用, 但目前对GiP的免疫调节靶细胞、识别受体、作用机制，以及免疫调节的结构基础仍缺乏研究。本项目获准实施后，以前期从胀果甘草中分离纯化的一个免疫活性多糖GiP-B1为研究对象，首先分析其对T、B淋巴细胞和巨噬细胞功能的影响，研究表明GiP-B1可全面促进巨噬细胞RAW264.7的免疫功能，对B淋巴细胞的增殖和的活化也有显著影响，表明巨噬细胞和B淋巴细胞是GiP-B1的免疫调节靶细胞。在此基础上，应用抗体封闭法筛选出GiP-B1在B淋巴细胞上的识别受体TLR4和CD19，GiP-B1在巨噬细胞上的识别受体TLR4和TLR2；并通过RT-PCR法和SiRNA技术验证了TLR4是GiP-B1在巨噬细胞上的重要识别受体。此外，本项目还研究了GiP-B1通过TLR4对巨噬细胞的活化作用，分析了TLR4基因沉默后GiP-B1激活巨噬细胞的胞内信号途径，发现GiP-B1干预巨噬细胞后可上调TLR4、MyD88、P65、IKBα的mRNA水平，显著上调NF-κB p65磷酸化水平，诱导-IκBα磷酸化降解，从而启动NF-κB信号通路；而当TLR4-siRNA1转染后，TLR4、MyD88、P65、IKBα的mRNA水平以及NF-κBp-P65、p-IKBα的蛋白则都相应显著下调，表明GiP-B1可通过TLR4介导的NF-κB信号通路激活巨噬细胞，阐明了GiP-B1激活巨噬细胞的分子机制。另外，采用部分水解及酶解的方法获得不同多糖组分并检测其免疫活性，确定胀果甘草多糖在参与免疫调节作用过程中的结构区域主要是a-D-GalA聚糖区和Rha-GalA聚糖区，初步阐明胀果甘草多糖的结构与免疫活性之间的效应关系。本项目的完成，有助于从细胞、分子水平上阐明具有RGⅠ型果胶多糖结构特征的胀果甘草多糖对机体的免疫调节作用机制，补充了胀果甘草多糖免疫调节作用的理论基础；同时，本项目中有关GiP-B1可控性降解及制备低聚糖的研究，对该类多糖结构与功能的阐明以及活性低聚糖药物的发现和设计也具有一定的指导意义。通过本项目，已发表论文4篇；申请专利1项，培养硕士研究生2名。