Aurora-A在猪早期胚胎首次有丝分裂过程中的功能与机制研究

Aurora kinase A (Aurora-A) is a serine/threonine kinase that functions in various stages of mitosis. Accumulating evidence has demonstrated that gene amplification and overexpression of Aurora-A are linked to tumorigenesis and increasingly recognized in cancer research. In recent years, Aurora-A has been shown to significantly involved in the regulation of oocytes meiosis, however, its roles in porcine early embryos development is still unclear, especially in porcine cloned embryos. Quantitative real-time RT PCR and Western blotting will be performed to analyze the expression of Aurora-A mRNAs and proteins, and the subcellular localization of Aurora-A proteins will also be determined by confocal microscopy. To investigate the significance function of Aurora-A in porcine early embryonic development, the expression of Aurora-A will be knocked down or overexpressed by microinjection of Aurora-A shRNA plasmid or Aurora-A mRNA．We will detect the expression of Aurora-A and its kinase activity changes after inhibition of mitogen-activated protein kinase(MAPK)signaling．The aim of this study is to determine the effects of porcine Aurora-A on the first mitosis of porcine IVF and SCNT embryos, so as to establish a basis for the further research on the development mechanism of porcine early embryos.

Aurora激酶A(Aurora-A)是一种参与细胞有丝分裂调控的丝氨酸/苏氨酸激酶。新近研究表明Aurora-A参与了卵母细胞减数分裂的调控事件，但有关该激酶参与猪早期胚胎首次有丝分裂的调控目前仍不十分清楚。本研究拟采用实时荧光定量PCR、免疫印迹和间接免疫荧光等方法检测Aurora-A在猪体外受精胚胎（IVF）与体细胞克隆胚胎(SCNT)胚胎首次卵裂过程中的动态表达规律及其亚细胞定位；并通过RNA干扰与mRNA显微注射研究Aurora-A表达抑制或过表达对猪胚胎首次有丝分裂过程的影响；最后通过特异性抑制试验，分析Aurora-A是否参与抑制丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)信号通路的调控，探讨Aurora-A调节猪胚胎有丝分裂的分子机制。以期揭示Aurora-A在猪早期胚胎，特别是克隆胚胎首次有丝分裂过程中的功能及其分子调控机制，为深入研究猪早期胚胎发育机制提供实验参考。

Aurora-A对于有丝分裂进程中的中心体复制、纺锤体组装、染色体分离等细胞分裂事件具有重要的调控作用，是目前体细胞，尤其是癌细胞有丝分裂调控领域的研究热点。而Aurora-A在猪这一重要家畜动物模型上，尤其是在卵母细胞向胚胎转换这一特殊时期的研究尚未见相关报道。Aurora-A是否参与猪卵母细胞向胚胎首次有丝分裂转换这一关键时期的分子调控？在此过程中Aurora-A又发挥什么样的功能？其调控机制又如何？这些问题的深入探讨对于揭示卵母细胞向胚胎首次有丝分裂转换这一特殊时期的调控机制具有重要意义。本试验首先采用间接免疫荧光结合激光共聚焦成像技术研究了Aurora-A在猪胚胎首次有丝分裂前后这一段关键时期的动态表达与亚细胞定位，结果发现Aurora-A在细胞分裂初期主要在核附近开始表达，在分裂前期集中在纺锤体两极，分裂期与纺锤体的位置极度相似；与微管蛋白α-tubulin共定位发现Aurora-A在分裂前期主要集中在纺锤体两极，在分裂期，则主要伴随着微管蛋白的表达而表达，并与纺锤体荧光几乎重叠，提示Aurora-A可能主要通过调节纺锤体α-tubulin的组装进而参与猪卵母细胞向胚胎早期有丝分裂转换的调控。通过特异性抑制剂MLN8054处理后，无论卵母细胞的第一极体排出率还是早期胚胎的卵裂率均显著下降，且细胞均发育阻滞在Pro-M期；进一步通过细胞超微骨架分析发现，当Aurora-A抑制后，纺锤体形态异常率显著升高，并伴随染色体排列紊乱。以上结果表明，Aurora-A与猪卵母细胞及胚胎分裂前期双极纺锤体形成密切相关。为进一步探讨Aurora-A调控猪卵母细胞减数分裂向胚胎有丝分裂转换的作用机制，将Aurora-A抑制后的卵母细胞与胚胎进行p-TACC3 免疫印迹检测与免疫荧光分析，结果表明，Aurora-A抑制后，p-TACC3 无论是蛋白表达还是荧光强度，均显著下降。. 综上，本研究证实Aurora-A在猪卵母细胞向胚胎首次有丝分裂转换进程中确有动态表达，且主要通过调节双极纺锤体组装进而影响卵母细胞减数分裂向胚胎首次有丝分裂进程的转换；揭示Aurora-A主要通过调节下游p-TACC3表达水平来调控细胞分裂前期双极纺锤体的形成，进而影响染色体的排列与分离，参与猪卵母细胞向胚胎首次有丝分裂转换这一关键时期的调控。