以氨肽酶N(APN/CD13)为靶点的环酰亚胺类肽化合物CIP-13F抗肿瘤转移及机制研究

氨肽酶N(APN/CD13)是参入癌侵袭与转移的基质金属蛋白酶。以APN/CD13为靶点，我们设计合成了全新结构的环酰亚胺小分子类肽化合物库并筛选出了候选药物CIP-13F。本课题拟在前期研究基础上，以高表达和转染APN/CD13细胞模型，用APN酶活性测定等确定CIP-13F对APN/CD13表达的抑制作用。以微血管生成和抗侵袭与转移试验等评价其抗癌转移作用。以CIP-13F为探针，以Western blot，ELISA，siRNA等方法测定pcDNA3.1-pAPN等转染细胞APN/CD13和MMP-2表达相关性，证明CIP-13F通过抑制APN-Ras-Raf-1-MEK1/2-ERK1/2信号通路，产生对MMP-2活性的下调节作用。该研究将对创新型环酰亚胺类肽化合物的研发奠定基础，其阐明的APN/CD13和MMP-2表达相关性及信号调控机制将为癌侵袭与转移的基础理论研究增加新内容。

氨肽酶N （Aminopeptidase N ,APN/CD13）是一种锌离子依赖性的外肽酶，在多种肿瘤细胞表面高表达，可降解细胞外基质，促进新生血管生成，从而促进肿瘤侵袭转移。基于APN的结构特点，课题组设计合成了以APN为靶点的小分子类肽化合物环酰亚胺类肽化合物CIP-13F。.本研究以 L-亮氨酰对硝基苯胺底物法分析 CIP-13F 对APN表达阳性的肿瘤细胞的 APN 酶活性的抑制作用。以 transwell chamber 法观察CIP-13F对ES-2细胞游走能力的抑制作用。以人脐静脉内皮细胞HUVEC体外成管型实验检测CIP-13F对内皮细胞成管型的抑制作用。通过建立Lewis肺癌自发性肺转移模型观察CIP-13F的抗肿瘤转移作用。.结果：CIP-13F 能抑制APN表达阳性的肿瘤细胞的APN的活性。 CIP-13F 能抑制体外生长的APN表达阳性的肿瘤细胞的增殖。CIP-13F能抑制ES-2细胞穿过人工基底膜的能力。CIP-13F对荷Lewis 肺癌小鼠的原发肿瘤灶具有较强的抑制作用。分别以 CIP-13F 50 mg/kg和100mg/kg 剂量尾静脉注射给药3周，肿瘤生长抑制率分别为 29.4% 和 45.8%。CIP-13F 100 mg/kg能够有效降低荷Lewis 肺癌小鼠的肺表面转移瘤灶的数量。以免疫组织化学法、免疫流式细胞术和 Western blotting 法检测 Lewis肺癌组织中APN的表达水平，发现 CIP-13F能明显抑制Lewis肺癌组织中APN的表达水平。分别以 Annexin V/PI 法、DNA片段法和TUNEL法检测 Lewis肺癌细胞的凋亡变化，发现CIP-13F 能有效诱导Lewis 肺癌细胞凋亡。CIP-13F能有效抑制HUVEC体外成管型。免疫组化法检测CD34表达水平评价肿瘤微血管密度MVD，显示CIP-13F能有效降低Lewis肺癌组织的MVD。另外，Western blotting 结果显示，CIP-13F 能降低 Lewis肺癌组织中血管生成相关因子 VEGF、bFGF和TGF- 的表达水平。.结论：环酰亚胺类肽化合物CIP-13F通过抑制APN的表达水平和活性，抑制肿瘤细胞的增殖和转移。CIP-13F 能有效的抑制移植瘤鼠的腋部原发肿瘤灶的生长，降低肺继发转移灶的数目。