以氨肽酶N(APN/CD13)为靶点的环酰亚胺类肽候选药物24f抗肿瘤转移作用研究

在解析APN/CD13结构基础上，借助靶点生物信息学和计算机技术，构建了全新结构的环酰亚胺小分子类肽化合物库，筛选出了3-(2-氨基-取代乙酰氨基)-2,6-哌啶二酮-N-乙酸衍生物24f具有很强的APN/CD13靶点抑制作用。以APN酶活性和Western blot等方法检测24f对肿瘤表达APN/CD13的抑制作用；以重组基底膜侵袭实验，Lewis肺癌自发转移、B16-F10小鼠黑色素瘤等不同动物转移模型，研究24f的抗侵袭转移作用；以血管内皮细胞微血管形成试验、内皮细胞丝足形成和CD34/MVD微血管密度法等评价24f体内外抗肿瘤微血管形成作用。在作用机制研究方面，以Western blot和siRNA等试验方法，研究24f对APN/CD13激活肿瘤细胞Ras-Raf-1-MEK1/2-ERK1/2信号传递的阻止作用，评价24f的抗癌转移作用机制。

按计划完成，1.以L-亮氨酸对硝基苯胺底物法分析24F对癌细胞APN/CD13酶活性抑制作用；以免疫流式细胞术和Western blotting检测APN/CD13表达；以transwell chamber观察24F对癌增殖和游走抑制作用；以裸鼠移植ES-2模型，尾静脉注射评价24F活性。以Hoechst 33258染色法、Annexin V/PI法检测24F对癌细胞凋亡作用；以Western blotting法检测凋亡蛋白表达，包括cleaved caspase-3和cleaved PARP；以碘化丙啶染色流式细胞术法评价24F对肿瘤细胞增殖周期的影响；以Western blotting测定24F对癌细胞内皮因子VEGF抑制作用。实验结果：24F对高表达APN/CD13细胞HL-60和卵巢癌ES-2 APN/CD13抑制作用强，以500μmol/L孵育60min，抑制率分别52.5%和61.7%。24F对低表达APN/CD13的SKOV3，PLC/PRF/5和ECV304酶抑制作用弱。24F对体外生长HL-60和ES-2细胞增殖具有一定抑制作用，明显抑制ES-2细胞穿过基底膜。24F对裸鼠体内生长ES-2具有较强抑制作用，分别以10，50mg/kg尾静脉给药，对肿瘤生长抑制率分别为31.0%和38.0%。以Western blotting及流式细胞术检测24F对肿瘤细胞APN/CD13表达，发现24F对体内生长的ES-2肿瘤组织APN/CD13抑制作用较强。24F诱导ES-2和HL-60细胞凋亡，流式细胞术发现凋亡比例增加，可能与其诱导凋亡相关蛋白caspase-3和PARP升高有关。检测细胞周期发现，24F能使HL-60细胞停滞于G0/G1期，阻止进入G2/M期。Western blotting结果显示，24F能降低ES-2细胞VEGF表达水平。环酰亚胺类肽化合物24F具有较强抗癌活性，其机制与其抑制APN/CD13活性和表达水平有关，通过降低肿瘤细胞APN/CD13酶活性和表达水平，抑制肿瘤细胞增殖；24F诱导肿瘤细胞凋亡可能与其抑制APN/CD13活性和表达水平有相关性，因而产生较强的抗癌活性。本课题累计发表署名本项目课题编号的SCI收录文章8篇，培养博士生1名，硕士生2名。课题组正按照国家FDA要求，评价动物体内药效学和作用机制，争取进入临床前研究。