miR-200b/Bcl-2通路参与调控人肺腺癌多药耐药表型形成的分子机制研究

microRNA(miRNA)通过对基因表达的转录后调节作用而参与调控多种生理和病理活动，但其在肿瘤化疗耐药表型形成中的作用仍不清楚。本实验室前期成功建立耐多西他赛人肺腺癌细胞株模型(SPC-A1/docetaxel)并进行miRNA芯片和蛋白质差异表达等检测，发现miR-200b在SPC-A1/docetaxel中表达水平显著下调，而Bcl-2表达上调，进一步采用生物信息学方法分析，发现Bcl-2基因的3'-UTR序列含有一个miR-200b结合位点。本课题拟针对miR-200b采用干扰和过表达技术通过体外细胞模型和活体动物模型分析miR-200b表达水平变化与人肺腺癌细胞对不同化疗药物敏感性之间的关系，并进一步探讨miR-200b通过转录后调控靶基因Bcl-2的表达而参与人肺腺癌细胞多药耐药表型形成的分子机制，为临床逆转肺癌多药耐药提供新的分子靶点。

化疗是肺癌综合治疗的重要部分，然而药物耐受造成的化疗失败是影响患者生存率的主要原因。本实验室前期通过体外逐步增加多西他赛浓度的方法诱导建立了稳定传代的人肺腺癌SPC-A1耐多西他赛细胞株（SPC-A1/DTX），本项目选取SPC-A1/DTX细胞中下调最为显著（约12.41倍）的miR-200b为主要研究对象。首先，人为恢复miR-200b表达，可在体内、外对肺腺癌细胞产生显著的多西他赛化疗增敏作用，同时伴有细胞增殖受阻、凋亡增加，以及细胞周期分布的明显变化。在临床组织样本中，miR-200b的表达水平与患者化疗敏感性及总生存期均存在正相关关系。接下来通过生物信息学分析及双荧光素酶报告基因实验证实E2F3是miR-200b直接调控的靶基因，人为下调E2F3表达可获得与过表达miR-200b时类似的体外效应，提示miR-200b对肺腺癌细胞的化疗增敏作用可能是藉由对转录因子E2F3的负性调控而实现。进一步，在SPC-A1/DTX细胞及亲本SPC-A1细胞中发现pri-miR-200b转录相关区域CpG岛均呈现完全甲基化状态，5-Aza-CdR处理后miR-200b表达明显上调但CpG岛甲基化程度无明显变化，提示miR-200b在SPC-A1/DTX细胞中表达下调受到DNA甲基化等表观遗传机制的调控，但并非由pri-miR-200b基因DNA甲基化的直接作用而引起。基于miRNA调控的网络性和复杂性，我们采用相似的研究手段对SPC-A1/DTX细胞中存在显著异常表达的其他miRNAs如miR-100、Let-7c、miR-650等进行分析，结果表明：SPC-A1/DTX细胞耐药表型的形成是miR-200b/E2F3、miR-100/Plk1、Let-7c/Bcl-xL、miR-650/ING4等功能轴通过影响细胞增殖、凋亡、细胞周期、EMT相关信号通路而产生的综合结果，各通路之间尚可存在交互调控。因此，本项目研究为深入理解miRNA网络调控在肺腺癌细胞耐药表型形成中的重要作用提供了理论基础，同时为临床逆转肺腺癌耐药、寻找疗效预测指标提供了新的策略。