脱氧羟腐胺赖氨酸合酶DHS与羟化酶DOHH催化真核翻译起始因子eIF-5A羟腐胺赖氨酸修饰的结构基础与分子机制研究

Eukaryotic translation initiation factor (eIF) eIF-5A is an ubiquitous protein translation initiation factor in eukaryotic cells and Archaea. It plays a critical role in regulating cell proliferation, cancer, virus infection and apoptosis. The function of eIF-5A requires an unique post-translation modification—Hypusine modification. The biosynthesis of hypusine is catalyzed from a conserved lysine in the N-terminal domain of eIF-5A and a spermidine in a two-step enzymatic reaction, which is catalyzed by Deoxyhypusine Synthase (DHS) and Deoxyhypusine hydroxylase (DOHH). Exploration of the interaction of eIF-5A with DSH and DOHH is helpful to understand the catalytic mechanism of hypusine modification and its regulation on eIF-5A function. We will study the interaction between eIF-5A, DHS and DOHH, and determine the crystal structures of the complexes, together with other biochemical and molecular biological approaches, we will illustrate the molecular mechanism of hypusine modification.

真核翻译起始因子eIF-5A是普遍存在于真核细胞和古细菌中的蛋白质翻译起始因子，在细胞增殖、癌症、病毒感染及细胞凋亡等过程中发挥重要的调控功能。eIF-5A的功能发挥依赖于一种特殊的翻译后修饰- Hypusine修饰。Hypusine修饰分别由Deoxyhypusine 合酶（DSH）和Deoxyhypusine 羟化酶（DOHH）参与的两步酶促反应完成，以亚精胺为底物将eIF-5A氨基端结构域中保守的赖氨酸残基修饰为Hypusine。研究eIF-5A与DSH、DOHH的相互作用方式，将加深对Hypusine修饰的催化机制及其对eIF-5A功能调控的分子机理的理解。本项目将开展对eIF-5A与DSH、DOHH的相互作用方式的研究及复合物结构的测定，结合细胞生物学、生物化学等方法，阐明DSH、DOHH与eIF-5A相互作用并催化其Hypusine修饰的分子机理。

真核翻译起始因子eIF-5A在细胞增殖、癌症、病毒感染及细胞凋亡等过程中发挥重要的调控功能。其的功能发挥依赖于一种特殊的翻译后修饰- Hypusine修饰。Hypusine修饰分别由Deoxyhypusine 合酶（DSH）和Deoxyhypusine 羟化酶（DOHH）参与的两步酶促反应完成，以亚精胺为底物将eIF-5A氨基端结构域中保守的赖氨酸残基修饰为Hypusine。本项目希望通过对Hypusine修饰相关蛋白质eIF-5A、DSH结构的测定，以及他们相互作用方式的研究阐明了DSH与eIF-5A相互作用并催化其Hypusine修饰的分子机理。在本项目的资助下，我们分别克隆、表达、纯化了酿酒酵母中eIF-5A、DHS和DOHH三种蛋白质，并通过体外实验验证了eIF-5A与DHS的相互作用。通过晶体筛选和优化，解析了酿酒酵母中DHS2.8Å分辨率的晶体结构。通过结构分析，我们发现催化位点位于两两二聚体的接触界面之间。此外，我们还解析了DHS与底物亚精胺以及辅因子NAD的复合物结构，分析了DHS可能的催化过程。我们通过共表达以及层析的方法得到了酿酒酵母中eIF-5A与DHS的复合物样品，并预测了两者相互作用的位点和作用模式；通过结构分析发现eIF-5A的修饰是通过电荷及氢键等相互作用的加强来帮助eIF-5A与下游靶蛋白进行结合。项目资助期间，已完成相关两篇英文论文，其中接收标注资助号的SCI 论文1 篇；与多个实验室开展合作研究，促进研究工作的进展；有2名硕士生参与到该项目的研究中，其中一名获得硕士学位。