p53对REGγ转录调控作用及其分子机制的研究

2006年，李晓涛教授发现了REGγ第一个细胞内完整的蛋白分子底物Src-3，这开辟了REGγ功能研究的新时代。目前已有报道显示，REGγ对细胞生长、增殖等重要生命进程发挥调控作用，并且与癌症的发生发展密切相关，许多癌组织中都检测到REGγ高表达。那么，是什么原因导致了REGγ在癌组织中高表达呢？我们希望通过研究其转录调控来解答这个问题。关于REGγ是如何被转录调控的，目前国际上还未见有任何报道。本课题通过生物信息学方法预测了REGγ启动子区域的一些调控元件，非常有意思的是，我们发现了p53蛋白的结合序列。进一步运用荧光素酶报告基因测活系统初步研究：显示野生型p53有抑制REGγ转录的功能，而突变的p53则促进REGγ的转录。这引起了我们极大的研究兴趣，进一步，我们将对其转录调控作用和机制进行深入研究。通过这些问题的阐明，希望能为癌症的诊断以及一些抗肿瘤药物的研发提供新的理论基础和靶点。

在国家自然科学基金委的大力支持下，该项目进展顺利。通过研究，我们首次揭示并详细阐明了REGγ的转录调控，及其与肿瘤间的相互关系。发表标注受本项目资助的高水平研究论文2篇；培养了2名博士研究生和2名硕士研究生。取得的主要科研成果简述如下：首先，我们结合软件预测与报告基因检测方法，发现野生型p53及TGF-β可以下调REGγ报告基因的表达，而突变型p53则可以上调REGγ报告基因的表达。利用siRNA技术下调几种不同细胞株中野生型p53表达或者直接检测p53敲除的细胞株中，发现REGγ蛋白及mRNA表达均上调；而利用药物刺激或过表达野生型p53后，REGγ蛋白及mRNA表达均下调。进一步，通过构建报告质粒突变体的手段确定了p53调控REGγ转录的顺式元件区域，并利用EMSA和ChIP技术在体内体外证实p53与REGγ启动子区域的结合；并且发现，p53通过招募一些转录抑制因子发挥其转录抑制作用。利用同样的思路，我们也发现，TGF-β也可以结合REGγ启动子区域并抑制REGγ转录。序列分析发现p53结合区域p53RE和Smad3结合区域SBE位于REGγ启动子上紧密相连的区域，利用super shift试验及ChIP试验证实Smad3和p53在REGγ启动子区域相互作用，最终达到TGF-β与野生型p53转录抑制的正协同效应。相反地，过表达突变型p53上调REGγ蛋白及mRNA表达；沉默突变p53的表达则下调REGγ表达；分析其与REGγ启动子区域结合情况发现突变型p53与REGγ启动子远上游区域结合，并招募转录共激活因子p300；另外，突变型p53的结合可以阻止Smad3及转录共抑制因子N-CoR在REGγ启动子区域的结合，表明突变型p53为功能获得型突变。此外，我们还分析了这些因子对蛋白酶体活性的影响，也得到了一致的实验结果。那么，这些实验结果会有什么潜在的应用价值呢？我们在多种肿瘤细胞株中研究发现，下调REGγ表达后可以减弱肿瘤细胞抗药性以及增强TGF-β的抗肿瘤效果，同时抑制肿瘤细胞增殖及细胞周期进程；而过表达REGγ可以促进细胞周期进程。最后，我们发现在肿瘤细胞株及临床癌症病人组织标本中p53的突变与REGγ高表达之间呈正相关性关系。总之，通过该项目的研究工作为肿瘤治疗提供了更多的理论依据。