亲合体靶向修饰的砷纳米药物在肝癌治疗中的作用及机制研究

Affibody is a new class of protein binding ligands. It has been used for the diagnosis and treatment of breast and skin cancers as a targeting molecule. The use of arsenic anticancer drug in solid tumors was exploited. In our preliminary experiments, we obtained anti-EGFR affibody (ZEGFR:1907) with high affinity by cloning techniques and protein purifications. We also used silica nanoparticles to load arsenic drug and found the targeted nanomedicines have about 4 times higher anticancer activity than free arsenic trioxide (ATO) in vitro. In vivo results suggest that affibody-targeted arsenic nanomedicines can significantly inhibit the growth of solid tumors. We expect the targeted nanoparticles can significantly improve the therapeutic effects of liver cancer and reduce the side effects. In this proposal, we will further investigate this drug delivery system: 1) to use several different liver cancer cell lines to test the activity; 2) to establish the orthotopic liver cancer models using human liver cancer cell lines, then study the therapeutic efficacy and targeting effect of arsenic nanomedicines; 3) to evaluate the biological safety of nanomecicines; 4) to study the mechanisms of apoptosis and inhibition of cell migration induced by arsenic nanomedicines, and further do the possible clinical translation. The aim of this work is to open a new avenue for targeted and efficient treatment of liver cancers.

亲合体是一类蛋白结合配体，被作为一种新的靶向分子用于乳腺癌、皮肤癌的诊疗研究；另有研究显示砷对实体瘤有一定疗效。我们将重组表达的高活性EGFR亲合体ZEGFR:1907与SiO2装载的镍砷纳米药物偶联，构建了一种新型靶向纳米药物Ni,As@SiO2-ZEGFR:1907，它对肝癌细胞的药效比三氧化二砷（ATO）提高了近4倍，初步的小鼠皮下瘤模型实验也证实了其可显著抑制肝癌生长并具有较强的靶向性。我们期望该靶向纳米药物能够显著提高肝癌疗效并降低毒副作用。本项目拟进一步研究：1、多种肝癌细胞验证其药效；2、建立裸鼠原位人肝癌模型，结合MRI 活体成像、质谱等方法评价其体内药效及靶向肿瘤能力；3、探讨其生物安全性；4、通过DNA ladder、Western blot、流式细胞、免疫荧光、qRT-PCR等方法阐明其具体作用机制，为其后续的临床转化研究奠定基础。本项目将为肝癌的靶向治疗开辟新途径。

砷剂由于其药代动力学和剂量限制毒性，对肝癌的治疗效果有限。亲合体是一类蛋白结合配体，我们利用其构建的靶向砷纳米药物：Ni,As@SiO2-ZEGFR:1907，与游离砷剂相比，可有效抑制肝癌细胞的恶性表型，在体内对肿瘤组织具有特异的靶向效果，能够显著抑制肝癌的生长，增强了药物疗效，且对小鼠正常器官无损伤，生物安全性良好。因此靶向纳米药物Ni,As@SiO2-ZEGFR:1907有望成为改善肝癌治疗现状的一个有效途径。在此基础上，我们又合成了锰砷纳米药物ALNPs，ALNPs能够有效抑制了肝癌细胞的迁移侵袭，裸鼠肝癌模型实验也证实了其显著抑制肝癌转移的药效。我们对其抑制肝癌转移的作用机制进行了进一步的研究，实验结果发现ALNPs能够有效输送As到肿瘤细胞内，破坏胞内微管结构并通过有效杀死血液中的循环肿瘤细胞，进而抑制肝癌的转移。由于锰的T1成像性质和砷的抗癌性质，使得该纳米药物同时具有诊断和治疗的功效。能够在体内对药物的释放进行实时监测，有望实现肝癌的诊疗一体化。另外，我们对NKD1蛋白调控肝癌细胞侵袭和增殖能力的作用和机制也进行了探讨。NKD1蛋白在肝癌中的表达量要明显低于癌旁正常的肝组织，且其低表达与肝癌患者的不良分化（P=0.003）、肝内外转移（P=0.01）和肿瘤大小（P=0.011）密切相关。同时在体内外实验中，我们也发现NKD1具有有效抑制肝癌细胞的侵袭转移能力，且其抑制肝癌细胞侵袭转移的能力是依赖Rac1的。NKD1通过调控Rac1影响肝癌细胞骨架重排，NKD1与Rac1在细胞浆中存有结合并缩短Rac1的蛋白半衰期；NKD1还能促进Rac1泛素化途径依赖的蛋白降解，同时Rac1也可通过减少EZH2的蛋白表达水平，促进NKD1的转录激活，进而抑制肝癌的生长和转移。相关研究结果揭示了NKD1调控肝癌侵袭转移能力的新机制。