高致病猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株与细菌内毒素的协同致病作用机制研究

Since 2006 there have been outbreaks of a severe form of PRRS in South China characterized by prolonged high fever. It has rapidly become endemic all of the China and causes devastating economic loss from then on. Several studies have confirmed that the causative agent of these outbreaks was a highly pathogenic strain of PRRSV (HP-PRRSV), and that secondary bacterial infection may also contribute to the high mortality. However, the molecular pathogenesis by which the HP-PRRSV and bacterial action in synergy is unknown. In this study, to determine the mechanisms by which HP-PRRSV and bacteria synergistically act for the occurrence of the characteristically high fever and high mortality, we used an in vitro model according to the previous report of foreigner scholars to investigate the positive regulation of LPS/TLR4 activation. The results will provide a prerequisite theoretical basis for better controlling and therapy of the disease.

2006年由高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株（HP-PRRSV）引起的"猪高热病"首先在我国南方部分地区暴发，并迅速在全国蔓延，此后，该病持续流行，给我国养猪业造成了极大灾难。研究表明HP-PRRSV与细菌的协同作用是导致"高热病"高死亡率的重要原因之一。然而HP-PRRSV与细菌协同致病作用的分子机制目前尚不清楚。本研究借鉴国外学者已经建立的PRRSV-LPS感染模型，通过研究 HP-PRRSV感染对LPS/TLR4活化的正向调控机制，鉴定HP-PRRSV基因组中发挥协同致病作用基因靶点，阐明HP-PRRSV与细菌协同作用机理，解析HP-PRRSV引起机体高热及高死亡率的分子机制，为临床防控该病提供理论依据。

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株（HP-PRRSV）给我国养猪业造成了损失，研究表明HP-PRRSV与细菌的协同作用是导致高死亡率的重要原因之一。本项目利用PRRSV和细菌内毒素LPS协同作用模型进行了体外实验，发现HP-PRRSV与LPS感染PAM 后能协同诱导产生高水平的促炎细胞因子IL-1、TNF-α，利用定量蛋白质组学分析发现HP-RRSV感染后能上调PAM中CASP3和CD14的表达，表明HP-PRRSV对LPS引起的TLR4激活发挥正调控作用。进一步研究发现PRRSV nsp2蛋白能够能够导致NLRP3炎性小体活化，Nsp2蛋白533~561位氨基酸缺失(HP-PRRSV)后能够增强Nsp2与NLRP3分子相互作用，促进NLRP3与其他炎性小体组分ASC，Caspase-1的组装，引起IL-1β的大量分泌。为揭示PRRSV与多种病原混合感染的发病机制，本项目研究了PRRSV感染后外周血中性粒细胞（PMN）的免疫功能变化。结果表明，PRRSV感染可显著降低PMN细胞结合免疫复合物及吞噬大肠杆菌的能力，而PMN功能的改变与细胞表面poFcγRIII的表达量密切相关，这一研究结果对于揭示PRRSV感染后继发多种病原的发病机制有重要意义。本项目利用稳定表达poFcγRIIb的MARC-145转染细胞株发现猪抑制型FcγR介导PRRSV和抗体复合物入侵。FcγRIIb被聚集的病毒-抗体感染性免疫复合物激活，启动下游信号通路，抑制I型干扰素和促炎性因子等抗病毒因子的产生，从而抑制胞内天然抗病毒反应，增强病毒的复制水平，引起胞内病毒持续感染。本项目通过蛋白质晶体学技术在国际上率先解析了PRRSV入侵必需受体CD163关键结构域SRCR5的三维结构，发现了CD163介导PRRSV入侵的关键氨基酸位点，对PRRSV防控有重要指导意义。