铜绿假单胞菌VI型分泌系统新型磷脂酶毒力因子PA0260的功能鉴定

In recent years, the type VI secretion system (T6SS) has been identified as a novel bacterial secretion apparatus, and is shown to possess a variety of biological functions in growing number of pathogenic bacteria. Phospholipase proteins, which are widespread in Gram-negative bacteria, were found to be a large family of virulence factors (Tle) of T6SS. Our work has identified a Pseudomonas aeruginosa phospholipase D protein called PldB. It belongs to the Tle5 family, and is secreted through the T6SS virulence island III (H3-T6SS). It can not only act on the bacterial periplasmic space but also play a role in host cells via PI3K / Akt signaling pathway. PA0260 protein was sorted to Tle3 family, and it contains a conservative GXSXG phospholipase activity domain. Preliminary work shows that it is also capable of targeting at bacterial periplasmic space, and may be correlated with the Pseudomonas aeruginosa T6SS virulence island II (H2-T6SS). This project will further investigate the biological function and secretion mechanism of PA0260, not only for the enrichment of Tle3 family protein function targeting prokaryotic cells but also for the future understandings of interplay between T6SS virulence factors and eukaryotic host cells.

六型分泌系统（Type VI secretion system, T6SS）是一种新型的细菌分泌装置，近些年在众多的病原菌中被证明具有多种生物学功能。广泛存在于革兰氏阴性菌中的磷脂酶蛋白是最新被发现的属于T6SS的超家族毒力因子（Tle）。我们的工作已经鉴定出铜绿假单胞菌的一种磷脂酶D蛋白PldB是通过该菌T6SS的毒力岛III（H3-T6SS）分泌的Tle5家族毒力因子，它不仅能作用于细菌的周质空间还能对宿主细胞的PI3K/Akt信号通路产生影响。PA0260蛋白隶属于Tle3家族，它具有保守的GXSXG磷脂酶活性区域，前期工作显示它同样能作用于细菌周质空间，并且可能与铜绿假单胞菌T6SS的毒力岛II（H2-T6SS）有着密切的关系。本研究拟通过鉴定PA0260的生物学功能及其分泌机制，为丰富Tle3家族蛋白对原核细胞的功能和进一步拓展对T6SS毒力因子与宿主相互作用的认识提供相应线索。

细菌六型分泌系统的磷脂酶蛋白Tle（Type VI lipase effector）广泛存在于多种病原菌中，它能够直接作用于细胞膜并降解其主要脂质成分。铜绿假单胞菌的基因组编码了多种Tle蛋白，其中Tle3（PA0260）和Tle4（PA1510）的功能还不甚清楚。申请人在前期的研究结果表明，Tle3具有针对细菌周质空间产生毒力作用的能力，其后编码了一个潜在的抗毒蛋白来抑制其活性，同时生物信息学及RT-PCR分析显示其可能与铜绿假单胞菌的H2-T6SS分泌相关。本项目在前期工作的基础上，通过基因敲除、免疫沉淀、生长竞争和蛋白质生物化学等多种技术和方法，分析研究了PA0260在细菌适应性生长中的作用，并对其分泌的分子机制进行了阐释。结果显示，PA0260确实能作用于细胞的周质空间来促进铜绿假单胞菌的竞争性生长，且该蛋白具有脂酶的蛋白活性，将其活性位点突变后能够消灭其毒性，同时PA0260能够与H2-T6SS的结构蛋白结合并通过其分泌。这些研究为进一步阐明Tle3蛋白的毒性作用机制提供了理论依据。在本项目的支持下，我们还对另一个磷脂酶蛋白Tle4的功能进行了探究。结果显示其也是通过铜绿假单胞菌的H2-T6SS分泌至细菌周质空间，并具有杀灭周围敌对细菌的效果。同时它还能被转运至真核宿主细胞的内质网中，诱导内质网应激以及自噬反应的发生，这对于磷脂酶蛋白的功能研究也是一个巨大的拓展。