半滑舌鳎tesk1和neurl3基因在精子发生过程中的功能研究

In Cynoglossus semilaevis culture, the W-sperm absence of pseudomale results in the nonexistence of super-female offspring. Therefore, it is necessary to investigate the functional genes involved in the spermatogenesis for application of pseudomale breeding, in order to improve the female proportion. Based on our previous work, two Z chromosome linked genes, tesk1 and neurl3, were identified as ideal models to reveal the relationship between W-chromosome-lacking genes and W-sperm absence. This study will focus on the following four aspects: (i) Temporal expression patterns of tesk1 and neurl3 using RT-PCR and Western blot in gonads from different developmental stages. (ii) Spatial expression patterns in specific germ cells using in situ hybridization and immunohistochemistry in paraffin sections of gonads at high-expression stages. (iii) Dissecting the relationship between gene-dosage and spermatogenesis after injection of siRNA and recombinant proteins to inhibit gene expression or mimic overexpression. (iv) Search for interacting partners via co-immunoprecipitation and establish preliminary interaction networks during spermatogenesis. In this study, the functionality of spermatogenesis-related genes will be elucidated in detail, thereby providing a fundamental basis to cope with the problem of W-sperm absence in pseudomale and further improve the sperm quality.

在半滑舌鳎养殖中，伪雄鱼W精子缺失导致无法产生超雌鱼后代，因此对精子发生过程中相关功能基因的研究是利用伪雄鱼育种提高雌鱼比例的关键。前期工作筛选到的两条Z染色体特异基因，tesk1和neurl3，为研究W染色体缺失基因与W精子缺失之间的关系提供了理想模型。本课题将从以下四个方面进行研究：（i）以不同发育阶段的性腺为材料，通过RT-PCR和Western blot研究其时间表达模式；（ii）对高表达时期的性腺进行石蜡切片，通过原位杂交和免疫组化研究其在不同生殖细胞中的分布；（iii）注射siRNA和重组蛋白对基因进行抑制或模拟过量表达，探索基因剂量与精子发生过程的关系；（iv）免疫共沉淀寻找互作蛋白，初步建立精子发生过程中的蛋白互作网络。本研究将详细探索半滑舌鳎精子发生相关基因的功能，为阐明伪雄鱼中W精子缺失机制，提高精子质量提供理论基础。

在半滑舌鳎养殖中，伪雄鱼W精子缺失导致无法产生超雌鱼后代，因此对精子发生功能基因的研究是提高雌鱼比例的关键。本项目主要以前期工作筛选到的两条Z染色体特异基因tesk1和neurl3，以及项目执行期间筛选获得的figla基因为研究对象，展开如下研究：（i）以不同发育阶段的性腺为材料，通过RT-PCR和Western blot研究其时间表达模式；（ii）对高表达时期的性腺进行石蜡切片，通过原位杂交和免疫组化研究其在性腺不同生殖细胞中的分布;（iii）在细胞系和活体水平上通过siRNA介导的RNA干扰对相关基因进行表达抑制，探索基因剂量与精子发生过程的关系；（iv）免疫共沉淀寻找互作蛋白，初步建立精子发生过程中的蛋白互作网络。.通过研究我们发现：（i）半滑舌鳎中在常染色体上的tesk1（Altesk1）并非在精巢中而是在卵巢中高表达，在精巢中的表达仅为卵巢表达量的5%左右，其在210天开始检测到明显表达，1年的卵巢表达量达到最高，且主要分布在卵母细胞中。Altesk1启动子区域在卵巢中的低甲基化可能是造成卵巢中Altesk1高表达的原因。我们推测Altesk1可能在卵子发生过程中发挥重要作用。（ii）对neurl3基因研究发现，其在精巢中的转录和翻译水平较高，且mRNA和蛋白主要分布在精巢的生殖细胞中。通过伪雄鱼体内RNA干扰实验，发现精子发生相关基因的转录水平发生了变化。通过比较了雄鱼和伪雄鱼中的蛋白泛素化模式，发现neurl3的转录水平与精巢蛋白的泛素化呈正相关关系，基于这些研究结果，我们推测neurl3可能通过调节精巢蛋白的泛素化参与精子发生过程的调控。（iii）figla基因通常与卵巢分化和发育密切相关。然而在舌鳎中我们发现了一个新的转录形式（figla_tv2），主要存在于伪雄鱼精巢的生殖细胞中。以伪雄鱼精巢细胞系为材料对figla_tv2进行RNA干扰，发现其影响激素合成相关基因。我们推测figla_tv2可能通过调节和类固醇激素的合成代谢影响伪雄鱼精子发生。.本项目详细探索了多个半滑舌鳎精子发生相关基因的功能，将为阐明伪雄鱼中W精子缺失机制，提高精子质量提供理论基础。