a-琼胶酶AgaD翻译后加工、水解机制及催化腔结构特征研究

Agarases are the glycoside hydrolases (GH) that hydrolyze agarose, polysaccharides from marine seaweed. According to the mode of action, they are classified into two groups, namely α- and β-agarases, which hydrolyze α-1,3 linkages and β-1,4 linkages of agarose, respectively. To date, thousands of agarases have been discovered, among witch only two are α-agarases. Moreover, the stduy of α- agarases was primary and basal. In the early studies we obtained a new alpha-agarase gene (agaD) from the marine bacteria Thalassomonas sp, while, the enzyme expression level was very low and there existed post-translational processing. To improve the protein expression level in E.coli, the gene was synthesized after codon optimization. This proposal will give a systematic study of this enzyme, including ① characterize of the wild and recombinant enzymes by optimizing fermentation conditions; ② determine the protein processing site by N-terminal sequencing and elucidate the maturing mechanism by separately and corporately expressing of each domains; ③clarify the active sites and hydrolysis mechanism using site mutation and NMR spectrum detection; ④ analyze the structure features of catalytic cavity by measuring the kinetic parameters and drawing the subsites binding map with oligosaccharides of different degree of polymerization. This subject will elucidate the maturing mechanism of α- agarases, furthermore, it will be beneficial for structure-activity relationship study of α- agarase.

琼胶属于海洋多糖，其降解酶按照作用方式分为α-和β-琼胶酶。在已发现的上千个琼胶酶中仅有2个是α-琼胶酶，其研究尚停留在酶分离纯化、酶学性质研究阶段。课题组从海洋细菌Thalassomonas sp.发现了1个新的α-琼胶酶（AgaD），研究显示野生酶和重组酶产量均很低且存在翻译后加工，通过密码子优化和全基因合成，构建了适于大肠杆菌表达的异源表达体系，提高了重组酶表达量，但可溶酶产率较低。本课题拟在前期基础上对AgaD进行系统研究，包括①优化发酵条件，提高野生酶和可溶性重组酶的产量，阐明酶学性质；②通过成熟酶Ｎ端测序确定酶的加工位点，构建各结构域突变体，探讨酶的翻译后成熟机制；③利用点突变和核磁技术阐明酶的活性中心和作用机制；④测定AgaD对寡糖的酶解动力学参数，绘制底物结合位点谱图，研究催化腔大小、结构特征。该研究将首次阐明α-琼胶酶翻译后成熟机制，并为α-琼胶酶的构效关系研究奠定基础。

琼胶降解酶在海洋红藻多糖的生态碳循环中发挥了重要作用，然而在已经发现的数千种琼胶降解酶中，仅有两个为α-琼胶酶而且相关研究非常薄弱。本项目拟对前期发现的一个新的α-琼胶酶AgaD通过优化发酵条件，提高产酶量，阐明相关酶学性质，并探讨酶的断裂机制、作用机制，研究酶的催化腔大小和结构特征。通过对发酵宿主的筛选、发酵条件的优化以及N端法则的考察，重组酶的产量提高了近500倍，达到达到11.3U/ml。研究了重组AgaD的分离纯化方法，在分离纯化过程中我们发现硫酸铵沉淀、TCA沉淀均可以引起重组蛋白的断裂，重组蛋白被断裂成了不同大小的活性片段，其中最小片段约为70kD，因此AgaD的断裂并不是翻译后修饰造成的。通过延长His标签的长度提高了重组酶的亲和纯化效率，获得了全长的电泳纯的重组酶，SDS-PAGE显示分子量在180kD，native-PAGE显示分子量约360kD表明重组酶为二聚体，纯化后的酶比活力为149U/mg。利用Time course曲线分析显示重组AgaD降解琼脂糖的方式为内切，降解终产物主要为琼四糖。发现了琼寡糖在碱性条件下，利用质谱、核磁分析表明主要降解产物琼四糖还原末端的3.6-內醚半乳糖被切掉，使主产物变为新琼三糖。利用不同聚合度琼寡糖对AgaD的催化腔进行研究，说明AgaD催化腔含有8个底物结合位点（-4 ~+4），其中（-2 ~+2）位点作用力较强，另外4个位点作用力较弱。AgaD降解新琼寡糖的最小底物是新琼六糖。根据氨基酸序列的保守性，选择了多个保守性的天冬氨酸和谷氨酸进行了突变，确定了催化区中的D506和D508为催化氨基酸。对野生菌株LD5进行了基因组测序，从中发现了另外一个α-琼胶酶AgaE，构建了AgaE的重组表达菌株，并对酶学性质进行了研究。本研究首次揭示了α-琼胶酶和其降解产物的不稳定机制，并对AgaD的催化腔特征进行了研究。