eIF2alpha在哺乳动物线粒体未折叠蛋白反应中的作用研究。

Mitochondrial unfolded protein response (UPRmt) is a recently discovered stress response, which is often activated in patients with Alzheimer disease (AD), Parkinson’s disease (PD) and other diseases. However, until now the mechanism of mammalian UPRmt is not clear, and the roles of UPRmt in human diseases is not known. In our preliminary work, we found that eIF2α is specifically phosphorylated during UPRmt. To study the function of phosphorylated eIF2α in UPRmt and the mechanism by which eIF2α is phosphorylated, we have established rapid and specific UPRmt induction systems. On the basis of the induction system, highly specific phosphorylated eIF2α inhibitor ISRIB will be used to study the function of phosphorylated eIF2α in UPRmt. Then lentivirus-based RNAi system and CRISPR-Cas9 gene editing system are adapted to knockdown/ knockout four eIF2α kinases, leading to figuring out of the kinases that phosphorylate eIF2α during UPRmt. Finally, we will test levels of phosphorylated eIF2α and UPRmt related genes in mouse model of Alzheimer disease, and analyze their correlations. Our work will lay a foundation for fully illustrating the mechanism of mammalian UPRmt and understanding the function of UPRmt in Alzheimer disease.

线粒体未折叠蛋白反应 (UPRmt) 是一种新发现的细胞内应激机制，在阿尔茨海默病（AD）、帕金森病（PD）等疾病中高度激活。迄今人们对哺乳动物UPRmt的分子机制及其在疾病发生发展过程中的作用还不清楚。我们前期研究首次发现UPRmt特异地促进真核翻译启始因子eIF2α的磷酸化。为了研究磷酸化eIF2α在哺乳动物UPRmt中的作用并确定磷酸化eIF2α的激酶，本项目在已构建了快速特异的UPRmt诱导体系的基础上，使用新型磷酸化eIF2α特异抑制剂ISRIB研究磷酸化eIF2α在UPRmt中的作用；通过RNA干扰和CRISPR-Cas9等技术分别沉默/敲除四种eIF2α激酶，以确定在UPRmt中磷酸化eIF2α的激酶；最后在AD小鼠模型中检验磷酸化eIF2α和UPRmt激活情况，分析其相关性，为进一步阐明哺乳动物UPRmt通路，深入了解UPRmt在AD中的作用奠定基础。

线粒体未折叠蛋白反应 (UPRmt) 是一种新发现的细胞内应激机制，在阿尔茨海默病（AD）、帕金森病（PD）等疾病中高度激活。迄今人们对哺乳动物UPRmt的分子机制及其在疾病发生发展过程中的作用还不清楚。我们前期研究首次发现UPRmt特异地促进真核翻译启始因子eIF2alpha的磷酸化。本项目旨在研究磷酸化eIF2alpha在哺乳动物UPRmt中的作用并确定磷酸化eIF2alpha的激酶。使用线粒体热休克蛋白TRAP1特异抑制剂G-TPP，我们建立了快速特异的UPRmt诱导体系。在HAP1或者smmc-7721细胞中，G-TPP处理1小时就可以显著诱导eIF2alpha磷酸化水平升高和ATF4蛋白水平上升。使用p-eIF2alpha抑制剂ISRIB可以抑制ATF4蛋白水平的升高以及后续CHOP的表达，说明eIF2alpha磷酸化对于UPRmt至关重要。接着，利用慢病毒介导的RNA干扰我们构建了分别敲低四种eIF2alpha激酶（HRI、GCN2、PERK、PKR）的细胞系。利用CRISPR-Cas9技术，我们构建了分别敲除四种eIF2alpha激酶的HAP1和smmc-7721细胞系。通过对敲低和敲除细胞系进行分析，我们发现HRI对于G-TPP诱导eIF2alpha磷酸化是必须的。最后，我们探讨了线粒体错误折叠蛋白激活HRI，磷酸化eIF2alpha的机制。透射电镜分析显示G-TPP处理2h、4 h线粒体形态正常，呈椭圆形，脊结构清晰；G-TPP处理6 h后，线粒体形态变圆、肿胀、脊消失，说明G-TPP短期处理对线粒体形态无影响。我们使用Seahorse细胞能量代谢分析仪对细胞氧化磷酸化和糖酵解能力进行了分析，结果显示G-TPP处理后氧化磷酸化过程和糖酵解过程均受到严重抑制。最后我们使用了邻近标记技术（通过MAVS-TurboID标记线粒体）检测UPRmt 过程中招募到线粒体附近的eIF2alpha激酶，结果显示4种激酶中只有HRI信号增强。 综上所述我们确定了在线粒体未折叠的蛋白反应过程，HRI激酶向线粒体周围富集，并磷酸化eIF2alpha，最终引起线粒体蛋白翻译的减少。