BPI在盘羊及其杂交后代抗支原体肺炎的作用机理研究

野生盘羊与巴什拜羊杂交为种间杂交，其杂交种对支原体肺炎的抗性减弱并造成在生长发育早期大量死亡，杀菌性/通透性增强蛋白（BPI）基因为抗病育种候选基因之一，在机体的天然免疫防御和抗病的过程发挥了重要作用。本研究以新疆野生盘羊、巴什拜羊及其杂交种为研究对象，以支原体肺炎为疾病模型，从羊的BPI基因入手，通过人工授精、RT-PCR、real-time PCR、基因测序、电镜观察、细胞培养、流式细胞、人工感染等研究手段，旨在克隆以上不同品种羊的BPI基因，进行比较基因组学分析；检测BPImRNA表达水平；比较不同品种羊BPI的功能，分析和验证该基因在抗支原体感染中起到的作用。以期从基因序列、基因表达、蛋白功能、实际抗病等多个角度去揭示BPI在杂交种疾病抗性减弱而死亡中所起到的作用，也为抗病选育提供有效依据。

野生盘羊与巴什拜羊杂交为种间杂交，其杂交后代羔羊易感MO并造成大量死亡，本项目以BPI基因为研究对象，针对杂交后代易感MO设计了相关实验内容，旨在揭示BPI在杂交后代羊疾病抗性减弱而死亡中所起到的作用，取得了以下研究成果：.1．利用RACE技术对上述三种羊的BPI基因cDNA全长序列进行了扩增及序列分析，证实野生盘羊、巴什拜羊及其杂交后代羊的BPI cDNA序列全长分别为1929 bp、1922bp和1939bp，其中ORF均为1452bp，共编码483个氨基酸，杂交后代羊与巴什拜羊相比其核苷酸序列同源性为99.45%，氨基酸序列同源性为98.76%，发现有12处碱基位点发生变异，直接导致6处氨基酸的改变。.2.利用基因重组技术分别克隆三种的BPI基因的N-端活性片段，在毕赤酵母中成功表达43kD融合蛋白，使用葡聚糖凝胶柱层析法对表达的重组蛋白进行纯化。.3.重组BPI蛋白体外功能研究证实，三种羊的重组BPI蛋白均能显著地抑制沙门氏菌和大肠杆菌的生长。盘羊、巴什拜羊的重组BPI蛋白对MO可起到明显的抑制作用，而杂交羊的无明显抑制效果。三种羊的重组BPI蛋白均能诱导血管内皮细胞发生凋亡。体外培养的粒细胞受到MO感染后，巴什拜羊的粒细胞表达BPImRNA水平显著高于杂交后代羊的水平，说明父母代羊的粒细胞在感染MO时可能表达更多的BPI蛋白。.4.重组BPI蛋白的治疗及免疫调节作用结果显示，重组BPI蛋白治疗组羔羊没有死亡，而杂交后代对照组死亡率33%；说明重组BPI蛋白对MO感染有明显的治疗作用。杂交后代羊人工感染MO，经重组BPI蛋白治疗后，血清IL-1β浓度显著下降，IL-4的血清浓度显著升高，IL-6的血清浓度显著降低，IL-8的血清浓度显著降低，IL-10的血清浓度显著升高，IFN-γ的血清浓度显著升高，TNF-α的血清浓度显著降低。说明重组BPI蛋白具有一定免疫调节功能，揭示了重组BPI蛋白治疗MO感染的免疫学抗病机理。感染MO后，杂交后代羊表达BPI的水平较低，注射重组BPI蛋白能促进杂交后代羊BPI的表达。.以上研究成果提示：杂交后代羊易感MO而死亡可能与杂交后代羊体内的BPI基因序列发生了改变，导致其功能发生变化存在关联，并与其BPI表达量减少和相关细胞因子有关。课题组至2015年12月止，共发表论文8篇，培养硕士研究生3名，达到了预期目标。