类泛素ISG15在盘羊、巴什拜羊及其杂交种的疾病抗性研究

野生盘羊与巴什拜羊杂交为种间杂交，其杂交种疾病抗性减弱并造成在生长发育早期大量死亡，类泛素ISG15是羊的疾病抗性相关基因，在机体的先天性免疫防御和抗病的过程发挥了重要作用。本研究以新疆野生盘羊、巴什拜羊及其杂交种为研究对象，以支原体肺炎为疾病模型，从羊的类泛素ISG15基因入手，通过人工授精、RT-PCR、real-time PCR、基因测序、细胞培养、流式细胞、人工感染等研究手段，旨在克隆以上不同品种羊的类泛素ISG15基因，进行比较基因组学分析，检测ISG15mRNA表达水平，比较不同品种羊类泛素ISG15基因的功能，分析和验证该基因在抗支原体感染中起到的作用。以期从基因序列、基因表达、蛋白功能、实际抗病等多个角度去揭示类泛素ISG15在杂交种疾病抗性减弱而死亡中所起到的作用，也为抗病选育提供有效依据。

本课题以ISG15为研究对象，针对盘羊与巴什拜羊的杂交后代易感绵羊支原体肺炎设计了相关实验内容，取得了以下研究成果：.1. 采用分段克隆策略完成了盘羊、巴什拜羊及其杂交代ISG15基因的克隆，证实盘羊、巴什拜羊、F1和F2代ISG15基因总长度分别为2117bp、2123bp、2074bp、2121bp；通过比较基因组学的方法对序列进行了分析，发现杂交后代的ISG15基因在mRNA序列，蛋白保守结构域数量，3D结构上与父母代的出现了差异。.2. 利用RACE技术对三种羊的ISG15基因cDNA全长序列进行了扩增及序列分析，证实盘羊、巴什拜羊及其杂交羊的ISG15 cDNA序列全长分别为642 bp、646bp和640bp，其中ORF均为474 bp，共编码157个氨基酸，杂交羊的ISG15cDNA序列出现碱基缺失和碱基突变较多；通过比较三种羊的ORF序列，发现杂交羊与父母代有3处核苷酸差异，其中一处核苷酸差异导致了杂交羊的氨基酸为络氨酸（Y），而盘羊、巴什拜羊在此处的氨基酸均为半胱氨酸（C）。.3. 利用基因重组技术分别表达盘羊、巴什拜羊及其杂交羊的ISG15基因，用Ni2+螯合亲和层析法对表达的蛋白进行纯化，效果较好。.4. 对重组ISG15蛋白体外功能研究证实，盘羊和巴什拜羊重组ISG15蛋白具有良好的促进淋巴细胞增殖活性，而杂交羊的活性较差。盘羊和巴什拜羊的重组ISG15蛋白对绵羊肺炎支原体可起到明显的抑制作用，而杂交羊的无明显抑制效果。.5. 重组ISG15蛋白的免疫调节作用及治疗结果显示，治疗组羊外周血淋巴细胞表达ISG15和IFN-γmRNA的水平呈上升趋势。血清中IL-2、IL-4的浓度升高，IL-6的浓度呈明显下降趋势。此外，治疗组没有死亡羔羊，而杂交羊对照组死亡率50%；证实重组的ISG15蛋白提高了抗病能力，改善了炎症状况，具有一定免疫调节功能和明显的治疗效果。. 以上研究成果提示：盘羊与巴什拜羊的杂交羊易感绵羊支原体肺炎而死亡，其原因可能是杂交羊体内产生的ISG15基因序列、结构发生了改变，使其生物学功能发生了变化，以及表达量减少，最终导致杂交羊对绵羊支原体肺炎疾病抗性减弱所致。课题组至2014年1月止，共发表论文7篇，在投论文4篇，培养硕士研究生3名，达到了预期目标。.