解析ERS负调控Twist1促ATF4/Runx2表达的分子机制及促进主动脉瓣钙化的作用

New studies have shown that the behavioral changes of valve interstitial cells are the central axis of the progression of aortic valve calcification (AVC) and that the endoplasmic reticulum stress (ERS) is the AVC origin factor. We found that ERS stress protein ATF4 was expressed in AVC valve, and it could be inhibited by Twist1, and ERS could inhibit Twist1 expression. Accordingly, we propose "ERS negative regulation Twist1 to promote ATF4 / Runx2 expression and then promote aortic valve calcification" hypothesis. To verify the hypothesis, carry out the following: ① to reveal ERS on Twist1 expression regulation and molecular mechanism research. ② To study the regulation of Twsit1 on ATF4 expression and its molecular mechanism. On the basis of clear ATF4 and Runx2 as the target genes of Twsit1 downstream regulation, it is clear that Twsit1 mediates the mechanism of ERS regulation of ATF4 and Runx2. ④ to determine the role of ERS-Twsit1 (-) - ATF4 / RUNX2 (+) - OCN cascade control system to promote valvular calcification.

新研究表明瓣膜间质细胞行为改变是贯穿主动脉瓣钙化(AVC)进展的中轴线，并明确内质网应激(ERS)是AVC始发因素。前期我们发现ERS应激蛋白ATF4在AVC瓣膜中表达，且其可被Twist1抑制，而ERS又可抑制Twist1表达。据此，我们提出“ERS负调控Twist1促ATF4/Runx2表达进而促进主动脉瓣钙化”的假说。为验证该假说，开展以下内容: ①揭示ERS对Twist1表达调控作用及分子机制研究。②分析Twsit1对ATF4表达的调控作用及分子机制研究。③在明确ATF4、Runx2是Twsit1下游调控靶基因的基础上，明确Twsit1介导ERS调控ATF4、Runx2作用的机制研究。④ 确定ERS-Twsit1(-)-ATF4/RUNX2(+)-OCN级联调控系统促进瓣膜钙化的作用研究。

本课题分五部分开展钙化性心脏瓣膜病（CAVD）钙化机制的研究。在第一部分研究中，检测内质网应激（ERS）在瓣膜间质细胞体外钙化模型中的激活；通过体外钙化模型证实靶向抑制ATF6表达后，可减少钙盐沉积和凋亡细胞比例。并且靶向抑制ATF6导致p-Fak、Caspase-3/8、Bax凋亡调控蛋白的表达量降低，而抗凋亡基因Parp表达升高，但对成骨细胞标志物OSX、OPN、Runx2的表达无明显作用。以上结果提示ERS通过ATF6-凋亡通路促进瓣膜被动性钙盐沉积。在第二部分研究中，证实ERS抑制TWIST1的表达，但促进RUNX2的表达。随后进一步检测TWIST1在瓣膜钙化中的作用，证实TWIST1在CAVD瓣膜中表达降低。在瓣膜间质细胞中升高或降低TWIST1均能调控RUNX2 mRNA和蛋白表达、ALP活性和钙盐沉积，提示RUNX2是TWIST1的下游靶基因。ChIP和荧光素酶报告基因检测进一步证实TWIST1能结合到RUNX2启动子区而调控RUNX2的表达。该部分研究提示ERS亦可通过TWIST1-RUNX2通路促进瓣膜间质细胞成骨分化介导的主动钙盐沉积。在第三部分研究中，检测到CAVD瓣膜低表达miR-214，高表达ATF4、SP7，并且ERS抑制miR-214的表达。通过体外细胞钙化模型和动物体内模型证实miR-214通过靶向抑制ATF4和SP7的表达，抑制瓣膜间质细胞向成骨细胞表型转分化和钙盐沉积。该部分研究提示ERS亦可通过miR-214-ATF4/SP7通路促进瓣膜间质细胞成骨分化介导的主动钙盐沉积。在第四部分的研究中，检测到SOX5在CAVD瓣膜中的表达量随钙化程度的升高而降低。通过体外瓣膜间质细胞钙化模型和分子机制研究，证实SOX5能直接调控TWIST1和RUNX2的转录表达，并且抑制瓣膜间质细胞向成骨细胞表型转化和钙化。这表明SOX5通过双向调控TWIST1和RUNX2的表达、促进瓣膜间质细胞向成骨细胞表型转分化和钙盐沉积。在第五部分研究中，探索bFGF通过抑制ERS调控瓣膜间质细胞钙化的研究。体外钙化模型表明bFGF抑制细胞模型中的钙盐沉积，并且加入bFGF后抑制ERS标识蛋白和凋亡蛋白GRP78、CHOP、BCL2、BAX、Caspase-3的表达。机制研究结果表明AKT、ERK通路被抑制后，bFGF抑制ERS作用减轻，瓣膜间质细胞钙化增强。