基于丝氨酸/苏氨酸的多肽连接反应的改进及其在翻译后修饰蛋白质合成中的应用研究

The post-translational modifications significantly increases the complexity of protein structure. The multiple modification sites, diverse modification types, and dynamic nature bring great challenges to the structure-function investigation of proteins. The chemical protein synthesis is the most important way to get the protein sample and related probe molecules carrying designated types of post-translational modifications at specific sites. As the important method for protein synthesis, the serine/threonine peptide ligation has broad application in the synthesis of proteins with post-translational modifications. Further improvement of the serine/threonine ligation according to problems we have met in the former research, such as the low solubility of the peptide fragments and low ligation efficiency, and the development of related new reactions and new methodologies, are quite important. Synthesis of HMGA1a protein based photo-crosslinking probes carrying multiple post-translational modifications using the improved serine/threonine ligation, will set solid basis for the understanding of the effect of post-translational modifications on the protein conformation and protein-protein interactions.

蛋白质的翻译后修饰极大的增加了蛋白质结构的复杂性。其众多的修饰位点，多样的修饰类型，以及动态变化的特性，给蛋白质的结构-功能关系研究单来巨大的挑战。蛋白质的化学合成，是获取在指定位点具有特定类型翻译后修饰的蛋白质样品和相关探针分子的重要途径。作为蛋白质合成的重要方法，基于丝氨酸与苏氨酸残基的多肽化学连接反应在具有翻译后修饰的蛋白质分子的合成中具有广阔的应用前景。针对前期研究中发现的部分多肽片段溶解困难、连接反应效率下降等问题，对丝氨酸/苏氨酸连接反应进行改进，进而发展相关的新反应与新方法，具有重要意义。应用改进的丝氨酸/苏氨酸连接反应，合成具有多种翻译后修饰高迁移族A1a蛋白的光交联探针，将为揭示翻译后修饰对其构象及蛋白间相互作用的影响奠定基础。

蛋白质的翻译后修饰极大的增加了蛋白质结构的复杂性。HMGA家族是一种染色体内的非组蛋白结构因子, 他包括HMGA1a， HMGA1b和HMGA2。通过研究发现，HMGA的表达量会随着胚胎的发育而逐渐降低，最后在成熟个体细胞中达到最低。然而，越来越多的证据表明：在多重癌细胞中（胰腺癌，甲状腺癌，结肠癌，乳腺癌等等），HMGA的表达量会出现异常升高，并且与癌细胞的恶性程度和转移潜能成正相关。因此，抑制HMGA的活性已经被认为是一种治疗恶性肿瘤的潜在手段。在此项目中，我们进一步优化了丝氨酸/苏氨酸多肽连接法、并进一步发展了Cysteine/Penicillamine Ligation (CPL)的多肽链接法。 利用这些多肽连接法我们精准合成了20多个含有各种定点修饰的HMGA1a蛋白。利用这些合成的、结构均一的HMGA1a蛋白，我们发现在K64，K66，K70，K73上的四乙酰化和在S98，S101，S102上的三磷酸化均会影响HMGA1a的对其相互作用蛋白的结合。进一步研究表明HMGA1a酸性尾结构域不直接参与蛋白质-蛋白质相互作用，但其磷酸化作用显着抑制了HMGA1a-P53相互作用。