甜菜谷氨酸合酶（GOGAT）特性及其与GS的协同作用机制

甜菜单产不高、含糖率呈下降趋势，已成为限制甜菜糖业发展的瓶颈问题。究其原因，施氮过量是关键，因此挖掘氮高效遗传潜力，成为关注焦点。本研究首次运用纯化的甜菜GOGAT酶的N端氨基酸序列与运用同源序列和RACE技术克隆的GOGAT基因编码的氨基酸序列比对，来证实克隆的GOGAT基因，明确GOGAT酶学和基因特性；采用抑促交叉试验进行GS与GOGAT协同作用机制研究，可打破当前氮素无机同化研究中偏重于GS的不平衡局面；通过氮素调控，采用荧光定量PCR和蛋白二维电泳分析技术，查明GOGAT不同类型（Fd-GOGAT、NADH-GOGAT）在甜菜组织中的时空分布和表达，实现基因-蛋白-活性水平的研究，为制定甜菜丰产高糖施肥措施服务。因此，本研究在作物栽培、营养生理和分子生物学交叉点上获取新知识，填补氮同化代谢基础性资料，对丰富作物科学理论有很大的学术价值。对提高氮效率，防止地下水污染具有重要意义。

甜菜单产不高、含糖率呈下降趋势，已成为限制甜菜糖业发展的瓶颈问题。究其原因，施氮过量是关键，因此挖掘氮高效遗传潜力，成为关注焦点。谷氨酸合成酶（GOGAT）是联系氮无机同化与有机同化的关键酶，对甜菜氮素高效利用有重要作用。通过研究，克隆得到GOGAT cDNA和gDNA序列，cDNA全长5075bp（NCBI登录号：JN967620）,基因组序列长9645bp，含10个外显子和12个内含子（NCBI登录号：JX492320），这项研究填补了甜菜上该基因自2001年获得398bp片段后，一直无法得到全长序列的空白；明确了甜菜GOGAT纯化条件，提取并分离甜菜叶片中GOGAT的两种同工酶Fd-GOGAT和NADH-GOGAT；测定完成不同类型GOGAT的全酶分子量和亚基分子量，Fd-GOGAT分子量为214KD, 有160KDa和54KDa两个亚基： NADH-GOGAT分子量为183KD，只有一个亚基；明确不同类型GOGAT的最适反应条件、对不同底物酶动力学特性，Fd-GOGAT较NADH-GOGAT稳定，最适反应温度为40℃, pH为7.7，该酶对底物L-谷氨酰胺、α-酮戊二酸和Fd专一，Km分别为2307μmol/L、940μmol/L和2.062μmol/L。NADH-GOGAT最适反应温度为35℃, 最适pH为7.3，该酶对底物L-谷氨酰胺、α-酮戊二酸和NADH的Km分别为3376μmol/L、2278 μmol/L和4.79μmol/L，；明确了不同类型Fd-GOGAT和NADH-GOGAT在叶片和根中占的比例，叶片中Fd-GOGAT占GOGAT总活力的78.04%，NADH-GOGAT占21.96%。块根中NADH-GOGAT占总活力的84.61%，Fd-GOGAT为16.39%，填补甜菜GOGAT酶的基础资料；首次阐明GOGAT基因在甜菜不同组织中的时空表达，揭示了甜菜不同组织中GOGAT与GS的协同作用机制，叶中NH4+同化以GS2/Fd-GOGAT为主，根中以GS1/NADH-GOGAT为主；阐明氮素对该酶活性的调控，揭示了GOGAT及其相伴产物与光合作用、蔗糖代谢、块根产量及含糖率的相关关系。该研究完善了甜菜氮同化代谢关键酶系统的理论体系，对进一步挖掘作物氮高效遗传潜力，大幅度提高作物氮效率，改善农业施肥中的硝酸盐给地下水带来的严重污染意义重大。