健脾止动汤对TS大鼠皮质-纹状体通路谷氨酸转运体及灭活酶GS干预作用的研究

Tourette syndrome is a common chronic neuropsychiatric disease at the onset of childhood. One of the main pathogenesis is thought to be an imbalance in neurotransmitters located in CSTC loop. Previous studies found that Jianpizhidong Decoction could inhibit tics of children and model mice. But the pathogenesis of TS could not be explained sufficiently by monoamine neurotransmitters imbalance in the striatum and substantia nigra pathway. According to preliminary basis and new findings about the imbalance of amino acids in TS, we put forward the hypothesis that Jianpizhidong Decoction involves in regulating imbalance of Glu-based amino acid neurotransmitter in cortical-striatal pathway. In this project, our research group will build up TS model rats by intraperitoneal injecting IDPN, detect Glu and GABA content and the ratio change in the striatum by means of vivo microdialysis jointing high-performance liquid, and test expressions and distributions of glutamate transporter GLAST, GLT1, VGLUT1 and inactivated enzyme GS in Glu neurons and astrocytes applying confocal laser scanning microscopy, Western blot and RT-PCR techniques. We are aiming to explore the mechanisms of Jianpizhidong Decoction regulating Glu, GABA imbalance and Glu reuptake and inactivation in the cortical-striatal pathway from the animal behavior, neurological biochemistry and molecular biology, reveal the scientific connotation of supporting Spleen and inhibiting Liver principle, and provide experimental and theoretical supports for further applications in clinic.

多发性抽动症（TS）是一种常见的儿童时期发病的神经精神性疾病，皮质-纹状体-丘脑-皮质（CSTC）回路中神经递质失衡是TS发病的主要机制。前期研究发现，健脾止动汤可有效抑制患儿及TS模型鼠的抽动行为，而纹状体单胺类递质失衡不能充分阐释其机制。结合前期基础及氨基酸类递质失衡参与TS发病的新发现，课题组提出健脾止动汤抗抽动作用与调节皮质-纹状体通路Glu及其循环代谢网络密切相关。本项目拟以亚氨基二丙腈建立TS大鼠模型；活体微透析联合HPLC法检测模型鼠纹状体Glu、GABA含量；共聚焦激光扫描、Western blot、RT-PCR法检测谷氨酸转运体及灭活酶GS在Glu神经元、星形胶质细胞的表达和分布。从动物行为学、神经生化学、分子生物学探讨健脾止动汤对TS大鼠皮质-纹状体通路Glu、GABA表达及Glu重摄取、灭活的调控机制，揭示扶土抑木法的科学内涵，为其临床推广应用提供实验依据和理论支持。

鉴于“神经递质失衡”仍被视为TS发病的主要神经生物学因素，且纹状体单胺类递质失衡不能完全阐释TS的发病机理，课题组提出TS发病可能与皮质-纹状体通路Glu及其循环代谢网络失衡密切相关。针对以上假说我们进行了深入的研究和探索，并试图寻找健脾止动汤的抗抽动作用靶点和机制。首先，我们对选择大鼠作为TS造模对象，通过腹腔注射不同剂量的IDPN，寻求最佳剂量的造模剂量，经过刻板运动评分、自主活动测试及神经递质含量检测结果，最终筛选优化出IDPN225mg/kg•d为TS大鼠造模的最合适腹腔注射剂量。该剂量诱导下的TS模型大鼠，抽动症状稳定，可明显模拟出人类多发性抽动症的主要临床特点，且纹状体Glu及GABA含量较空白组差异有统计学意义。其次，我们采用活体微透析技术对TS大鼠纹状体透析液中Glu、GABA的含量进行了检测，结果表明在各个时间点上，模型组Glu含量最高，空白对照组含量最低。与模型组纹状体细胞外液Glu水平相比，健脾止动汤组有4个时间点（15、105、135、165min）明显降低，提示健脾止动汤能降低纹状体细胞外液中Glu的浓度，其抗抽动效应在此时间段最明显。在对GLAST及VGLUT1的影像及蛋白、基因表达研究中，我们发现GLAST呈散在点状分布或者聚集于星形胶质细胞轴突旁，二者有部分共定位，而VGLUT1与神经元无明显共定位；无论是蛋白含量还是基因表达，空白对照组最高，模型组最低，泰必利组及健脾止动汤组高于模型组，而略低于空白对照组，但各组间比较差异无统计学意义；而VGLUT1在模型组表达最高，空白对照组表达最低，各组间差异无统计学意义，结果表明健脾止动汤可明显抑制TS大鼠的刻板运动及自主活动，其抗抽动作用可能通过增加谷氨酸转运体GLAST表达，进而降低突触间隙Glu浓度实现。空白对照组GLT1基因表达显著低于模型组，泰必利组及健脾止动汤组较模型组有显著下降，但两组间无差异，提示纹状体GLT1表达变化可能与TS发病有关。此外，我们还发现健脾止动汤可通过上调GS表达起到抗抽动作用。本项目主要实验内容业已完成，实验结论陆续发表于国内各大核心期刊。