FGF23对猪小肠Na/Pi-IIb型磷吸收的调控作用和机理

Phosphorus is a mineral element which plays an important role in animal metablisms.But because the absorption and regulation mechanism is not entirely clear, the nutritional requirements can't be accurately assessed and lower phosphorus availability.Thereby,it causes serious environmental pollution as well as the waste of resources.FGF23 is a newly discovered hormone protein which regulates phosphorus absorption of renal Na/Pi-IIa, but small intestinal Na/Pi-IIb has not been studied yet..Pigs are the main animals that produce the phosphorus emissions while intestinal Na/Pi-IIb is the most important cotransporter protein for phosphorus absorption,but the effects of FGF23 on it have not been reported. Therefore, this project intends to prove the effects of FGF23 regulation of intestinal Na/Pi-IIb phosphorus absorption by RNA interference(RNAi) combined with the animal experiments,and study the mechanism in the following respects: First, the pathway of FGF23 affect the expression of receptors and enzymes of vitamin D transfering to the active one, and also infer the relationship between that process and phosphorus absorption..Second,the effects of FGF23 on kinetic parameters of intestinal brush border membrane transport of phosphate ion. Last, the relationship of different dietary phosphate content and FGF23 or phosphorus absorption. .The completion of the project for the absorption of phosphorus and regulation would lay a new pastive theoretical basis and improve phosphorus utilization.

磷是动物体内具有重要功能的矿物元素，但由于对磷的吸收和调控机理未完全明确，导致不能准确评定磷的营养需要量、磷的利用率低等问题，并由此引起磷资源的浪费和严重的环境污染。FGF23是最新发现的调节肾脏中磷吸收（Na/Pi-IIa型）的重要因子，但对小肠中磷吸收（Na/Pi-IIb型）的影响未有研究。猪是磷污染排放的主要动物，磷吸收以小肠Na/Pi-IIb为主要载体蛋白，FGF23对其表达和磷吸收是否有影响，其机理如何，未见报道。因此，本项目应用RNA干忧技术、结合动物试验，探明FGF23对猪小肠磷吸收的调控作用，并从三方面探讨其调控机理：①FGF23对维生D转化活性形式过程中相关酶和受体基因表达的影响及其与磷吸收的关系；②对小肠刷状缘囊膜转运磷动力学参数的影响；③日粮中不同磷水平与FGF23、Na/Pi-IIb表达和磷吸收的关系。.项目的完成将为磷的吸收与调控机制奠定新的、积极的理论基础。

项目从四个研究内容着手，分别取得如下重要进展：（1）采用RT-PCR和Western Blot检测了FGF23在猪各组织（器官）中的表达，获知FGF23 mRNA在肝脏和头骨中表达，在肾脏、脾脏、小肠等其余组织不表达，且头骨中的表达量最多（为肝脏组织的5.79倍）。通过Western Blot检测发现，FGF23蛋白在头骨和空肠中不表达，在十二指肠、肾、脾、肝、和血液中表达，且在肝脏中表达量最多。说明FGF23 在猪各组织中mRNA和蛋白表达存在差异性。（2）通过FGF23与维生素D的相互关系及其对小肠Na/Pi-IIb表达和磷吸收调控的作用途径研究表明：FGF23和维生素D3对小肠和肾脏中Na/Pi-Ⅱb载体转运蛋白mRNA表达量和磷吸收的影响存在互相调控的作用。当维生素D缺乏时，低磷日粮中FGF23可调控CYP27B1 mRNA表达来调节血液磷水平。同时还证明，维生素D3对磷代谢的调控作用符合基因学说观点。维生素D3缺乏后，补充维生素D3对磷吸收有提高作用，但这种作用随着磷水平的增加逐步减弱。FGF23在这个过程中，依据维生素D存在状态调控血磷水平和磷的吸收。（3）构建了FGF23载体和并对其测序：通过构建FGF23基因载体，并对基因测序获知了FGF23 2/3以上的基因序列，但验证发现：PCR结果与预期片段长度不符合，预期PCR扩增片段为747bp，而实际扩增片段仅为500bp左右，且扩增特异性较差。原因可能是所参考序列为预测序列，（软件分析或拼接序列），并非真实可靠的。扩增产物经测序比对后，其中扩增产物的5’端130bp的序列与预测序列一致，也说明该预测序列与实际的基因序列存在偏差，故无法进行后续克隆构建实验，即未能完成全长测序。（4）确定了FGF23对猪小肠BBMV磷吸收的动力学参数为：生长猪BBMV对磷的主动吸收在酸性pH下受到抑制。钠离子水平影响 BBMV磷的主动吸收，pH7.4条件下，转运 1个磷酸根，至少需要2个钠离子与其协同转运。本研究首次表明，NaPi-IIb 磷转运系统主要存在于猪回肠中，而在十二指肠中NaPi-IIb介导的磷吸收较少。本项目的试验结果为探明动物对磷吸收与利用的机理提供了新的研究角度，为进一步研究调控磷吸收的新型因子FGF23铺奠了基础。