染色体1p12和4q31.1区域遗传变异与先天性心脏间隔缺损发病机制研究

Although polygenetic low-penetrance inheritance is consider as one of the major genetic mechanisms of congenital cardiac septation defects,to date, the potential mechanism has not been fully elucidated. Our latest congenital cardiac septation defects GWAS study has identified two new tagging loci at 1p12 and 4p31.1 region, however, the exactly genetic etiology and mechanisms of congenital cardiac septation defects in these regions are unclear. On the basis of our previous GWAS study, this project is proposed to firstly perform fine-mapping study using a large-sample case-control design. The positive variants will further detect in vitro functional studies by real time PCR, western blot, EMSA and ChIP. Finally Xenopus laevis is selected as the heart development model to examine the fucnction of regulatory genes which convicted in vitro functional studies in heart development in vivo by whole-mount in situ hybridization, overexpression and knockdown experiments. The results of this project could improve our understanding the etiology and mechanisms of congenital heart disease development, which in turn is important for early detection, preventtion and targeted treatment.

多基因低共显性遗传是先天性心脏间隔缺损发生的主要遗传机制之一，迄今对其多基因遗传的机制尚未完全阐明。我们前期的全基因组关联研究（GWAS）显示，染色体1p12和4q31.1区域遗传变异与先天性心脏间隔缺损的发生紧密相关。在本研究中，我们将对中国汉族人群染色体1p12和4q31.1区域展开精细定位，对于潜在功能遗传变异进一步通过real time PCR、western blot、EMSA、ChIP等实验方法进行功能研究，鉴定致病位点。对于候选调控基因将应用非洲爪蟾作为心脏发育模型，采用胚胎整体原位杂交、基因过表达及基因敲减等实验方法，探讨其在体内心脏发育中的作用。本研究以前期GWAS研究发现为基础，从人群、细胞、组织以及动物整体水平探讨先天性心脏间隔缺损的发病机制，将为先天性心脏病早期筛查、预防和治疗提供依据。

本课题组率先在中国汉族人群中开展大样本、多阶段的先天性心脏间隔缺损（CHSD）全基因组关联研究（GWAS），采用Illumina Omni Zhonghua芯片对945名CHSD病例和1246名健康对照进行全基因组水平变异位点的扫描，随后对阳性位点展开两轮大样本的独立验证研究 (第一轮验证1578病例-2301健康对照; 第二轮验证582病例-1565健康对照)，结果显示位于1p12区域的rs2474937位点和4q31.1区域的rs1531070位点与CHSD的发生显著相关。此外,我们采用独立的1120例先天性心脏病其他表型病例与3866例健康对照进行第三轮验证，结果显示这两个位点与先天性心脏病其他亚型的发生同样相关。为了进一步探讨该两个区域与CHSD发病关联的强度及其机制，我们完成了针对1p12与4q31.1区域精细定位标签位点的芯片检测工作, 并选择阳性位点使用在线预测网站Regulome DB 及eQTL进行位点的功能预测, 针对发现的4q31.1区域的潜在功能位点rs1511455及rs17288919进行功能研究，以pGL3-Promoter载体为基础，通过定点突变构建不同等位基因的表达载体，用脂质体介导法将含不同等位基因的质粒及对照质粒分别转染至HEK293T及H9C2细胞系，采用双荧光素酶报告基因分析的方法检测不同等位基因对基因转录调控作用。结果显示rs1511455及rs17288919位点变异并未调控MAML3基因的转录。分析原因考虑基因变异位点调控基因表达机制较为复杂,具体方式有待进一步研究。.为了进一步探索新的可能具有功能意义的致病位点，我们针对前期GWAS研究中发现的P值介于10-4-10-5之间的位点，展开了延伸性的两阶段的验证工作（第一轮验证2770名病例-3911名对照；第二轮验证1095病例-2379对照），结果显示rs1400558，rs7863990，rs2433752和rs490514位点与CHSD发生显著相关。同时我们针对欧洲人群法洛氏四联症GWAS研究结果，在中国汉族人群中采用大样本的病例-对照研究（1010病例-1962对照）进行验证。研究发现10p11区域的rs2228638位点与中国人群法洛氏四联症的发病风险显著相关。拟下一步就以上位点进行功能研究。