Toll样受体4在胆管纤维化形成中的作用及机制研究

Bile duct disease mainly cause the biliary epithelial cell damage, and fibrosis is the key point during its development. Biliary fibrosis is remarkably associated with infection, however the mechanism is nuclear. Toll-like receptor 4 (TLR4), the natural receptor of lipopolysaccharide, has important roles in inflammation regulation. And biliary fibrosis is also associated with epithelial- mesenchymal transition. So we postulate that TLR4 may have important roles in EMT caused by bile duct infection. In present study, we detect the TLR4, epithelial markers and mesenchymal markers expression in bile ducts of hepatolithus, and then study the mechanism of TLR4 in EMT using small RNA interference and TLR4 gene knockout mouse model. The aim of this study is to enrich the pathogenesis of biliary fibrosis and also to procide more potential research evidence for clinical therapy of biliary fibrosis.

胆管病是对作用于整个肝内胆管树、以及胆管上皮细胞为主要攻击靶点的一类疾病，胆管树在遭受损伤后，胆管树纤维化是关键步骤。胆管纤维化与胆道感染关系密切，但具体机制尚不明确。Toll样受体4 (Toll-like receptor 4，TLR4) 是脂多糖的天然受体, 为炎症反应的调节、细胞信号转导的关键。同时胆管纤维化可能与上皮-间叶转变直接相关，故TLR4可能在胆道感染过程中胆管上皮-间叶转变形成中发挥关键作用。本项目拟检测来自胆管结石患者的胆管组织中TLR4、上皮、间叶及纤维标志物的表达，并观察这些因子的关联作用。体外实验中，采用脂多糖模仿胆道感染，剌激胆管上皮细胞，观察上述信号分子的表达特征。并采用siRNA抑制TLR4表达，研究TLR4在胆管上皮-间叶转变中的可能机制。建立动物模型，利用TLR4基因敲除小鼠观察脂多糖诱导的胆管纤维化的作用，以期为临床治疗胆管纤维化提供帮助。

胆管病是对作用于整个肝内胆管树、以及胆管上皮细胞为主要攻击靶点的一类 疾病，胆管树在遭受损伤后，胆管树纤维化是关键步骤。胆管纤维化与胆道感染关系密切， 但具体机制尚不明确。Toll 样受体 4 (Toll-like receptor 4，TLR4) 是脂多糖的天然受体, 为炎症反应的调节、细胞信号转导的关键。同时胆管纤维化可能与上皮-间叶转变直接相关， 故 TLR4 可能在胆道感染过程中胆管上皮-间叶转变形成中发挥关键作用。本项目拟检测来自胆管结石患者的胆管组织中 TLR4、上皮、间叶标志物的表达，并观察这些因子的关联作用。体外实验中，采用脂多糖模仿胆道感染，剌激胆管上皮细胞，观察上述信号分子的表 达特征。并采用 siRNA 抑制 TLR4 表达，研究 TLR4 在胆管上皮-间叶转变中的可能机制。建立动物模型，利用 TLR4 基因敲除小鼠观察脂多糖诱导的胆管纤维化的作用，以期为临床治 疗胆管纤维化提供帮助。 研究结果发现，胆管结石病患者胆管上皮细胞的上皮标志物表达缺失，间质标志物表达增加，发生了EMT现象，且这一过程伴随了TLR4表达的增加。在体外实验中，利用脂多糖刺激人肝内胆管上皮细胞，短梭形的肝内胆管上皮细胞逐渐变成长梭形多突起的间质细胞，利用免疫组化及PCR检查结果显示，随着脂多糖刺激时间的延长，上皮标志物(cytokeratin 7、19 、E-cadherin)表达降低，间质性标志物(MMP-2、collagen I/II、N-cadherin、vimentin、β -catenin)、核转录因子 twist、snail以及TLR4的表达增加，沉默了人肝内胆管上皮细胞TLR4后，相关EMT分子的表达与正常细胞的表达变化无明显差异，且其表达量不随着脂多糖刺激时间的改变而改变，说明TLR4在脂多糖诱导的人肝内胆管上皮细胞发生的EMT中起着关键作用。在动物模型中，利用胆管内注入脂多糖模拟体内胆道感染环境以及尾静脉注入siRNA-TLR4沉默TLR4表达，得出脂多糖能在体内能诱导胆管上皮细胞发生EMT，在沉默了TLR4后脂多糖诱导的EMT现象得到了减轻。所有结果表明，TLR4在脂多糖诱导的肝内胆管上皮细胞发生的EMT中起着关键作用，这将为胆管病的发生发展及防治提供新的视野。