小鼠牙齿发育中Wnt分子的组织来源及作用机理的研究

Mouse Wntless (Wls) encodes a multi-transmembrane protein that specifically regulates secretion of Wnt proteins. We could get insight into the tissue source of Wnt by studying the functional role of Wls in epithelial/mesenchymal organogenesis. In our preliminary study we discovered that, by means of Cre/Lox recombination system in mouse models, tooth development arrested prior to morphogenesis in the oral epithelial absence of mouse Wls protein; in which the Wnt/canonical signaling was dramatically down-regulated as well. These leads to our hypothesis that the functional Wnt source is the dental epithelium in tooth morphogenesis and, Wntless could governs the tooth morphogenesis through controls the secretion of Wnt protein in producing cell. We plan to test these possibilities by pursuing following experiments: 1) To elucidate the interaction between Wntless and epithelial expressed Wnt proteins through both in situ and in vitro protein approaches and define the requirement of Wntless for Wnt secretion in tooth germ development; 2) To explain the molecular mechanism of tooth morphogenetic arrest, in which Wntless was specifically deleted in oral epithelium, by in situ hybridization for RNA expression, immunohistochemistry for antibody staining, and cell activities in development of dental epithelium. (3). To detect the odontogenic inductive and competent potentials of oral epithelium in the absence of Wntless function, by means of tissue recombination and genetic approaches.

小鼠Wntless（Wls）与果蝇等同源并特定调节Wnt蛋白分子的分泌过程。因而对牙胚上皮及间充质发育Wls功能的研究会反映出器官发育中Wnt分子的来源。利用Cre/Lox手段我们发现牙胚上皮失去Wls后牙齿形态发生不能进行，并伴随牙胚中Wnt信号水平下降。得到的设想是牙齿形态发生中功能性Wnt分子的来源于上皮组织，Wls通过对Wnt分子在分泌水平的调节实现对牙齿形态发生的控制。本项目拟从3方面验证上述可能性。1）利用分子原位杂交，抗体免疫组化,细胞活动等对上皮组织Wls条件敲除后牙齿缺陷形成机理分析阐明形态发生受阻与Wnt信号水平间的关系；2）利用体外蛋白质技术以及组织重组技术找出Wls与牙胚上皮表达Wnt分子的作用，并证明牙胚发育中Wnt配体的分泌依赖Wls 3）利用器官组织重组及Osr2基因敲除小鼠多齿遗传模型研究Wls突变胚胎牙胚组织的牙向诱导能力及对诱导的反应。

Wnt信号在哺乳动物牙齿及相关口腔颅颌面发育过程中起着重要的控制作用。本项目利用基于Cre/Lox系统的条件性基因敲除手段，通过从胚胎口腔颅颌面上皮组织及间充质组织敲除控制WNT蛋白分泌产生功能的小鼠Wntless基因功能后对牙齿，舌器官，上腭，颅面部，上皮等器官发生影响的遗传学分析，体外组织重组培养分析，分子表达分析，及ChIP分析,体外基因双荧光酶活性分析等细胞生物学与生物化学方法，阐明了牙齿及其他颅颌面器官发育中WNT信号的组织来源及功能。通过本项目研究提供的大量实验证据证明：牙向上皮组织是牙齿发育中经典WNT信号的主要组织来源，利用K14-Cre敲除口腔上皮细胞中Wntless (Gpr177),造成牙齿发育在帽状期之后形态发生过程的缺陷。通过突变与野生牙向上皮组织与野生牙间充质的组织重组实验证实牙齿发生中通过上皮组织自身的WNT信号控制牙齿的形态发生。本项目还首次发现，胚胎发育中牙向上皮组织Wntless对于上皮组织中WNT蛋白分子分泌产生的调节会反馈性的调节上皮组织Wnt分子表达水平的不同反应。 本项目还证实，小鼠口腔器官中，上皮组织发生的Wnt配体，通过与位于真皮组织细胞中的BMP信号与FGF信号轴对控制上皮组织复层化过程的基底层细胞增殖的转录因子P63的转录发生影响，从而可能为与口腔上皮增厚成上皮牙板相关的牙上皮的覆层化机制首来源于上皮组织产生的Wnt分子调节提供新的基因功能研究证据。通过敲除小鼠胚胎颌面原基上皮中的Wntless基因功能，本项目还发现上皮组织来源的WNT信号通过对BMP/FGF与JNK信号控制颅面原基发生中细胞迁移过程；本项目的研究还通过失活舌原基上皮产生分泌Wnt配体蛋白功能，首次揭示上皮组织产生的WNT分子对于舌肌肉，黏膜固有层的完整性；对于舌味蕾的发生具有不可缺少的控制功能。而对于口腔内另一个重要器官上腭的发育，间充质产生分泌对其正常发育发生调节的WNT分子，这些WNT分子其信号通路调节上腭间充质前部Msx1/Shh通路的活动。综上所述， 本项目的数据阐明了包括牙齿在内的主要口腔内颅颌面器官发育控制中WNT信号分子的组织来源及相关功能。