雌性骨髓间充质干细胞悬滴培养形成卵泡样结构和产生性激素的研究

骨髓间充质干细胞可分化为表达LHR和产生雄激素的细胞，雌鼠骨髓干细胞（FBMSCs）可表达生殖细胞启动减数分裂的基因Stra8和卵巢颗粒细胞表达的FSHR，FBMSCs移植可在受体鼠卵巢内形成新生卵母细胞和卵泡，怀孕但未产生成熟的卵母细胞，产下受体鼠生殖细胞来源的后代，表明FBMSCs具有分化为构成卵巢卵泡的卵母细胞、颗粒细胞和卵泡膜细胞的干细胞存在，卵泡这三种细胞合适的相互作用卵母细胞才能发育成熟，但由于移植受体本身的许多因素均可影响供体细胞的分化和发育成熟，因而本研究采用离体培养的FBMSCs，悬滴培养3天再转入平板培养，观察视黄酸、绝经期血清、HCG对FBMSCs分化、形成卵泡样结构的影响，测定特异细胞标志和性激素，判断是否产生有功能的卵泡和卵母细胞，为哺乳动物卵母细胞和卵泡更新及其骨髓细胞来源、诱导分化因素提供证据，为进一步的移植和形成人造卵巢研究奠定基础，为卵巢早衰治疗提供思路。

临床有骨髓移植病人成功妊娠生育报道,实验发现雌鼠骨髓间充质干细胞(FBMSCs)移植可在受体鼠卵巢内形成新生卵母细胞和卵泡,表明FBMSCs具有分化为构成卵泡的卵母细胞、颗粒细胞和卵泡膜细胞的能力,由于移植受体的许多因素可影响供体细胞的增殖、分化和发育,本研究采用FBMSCs悬滴培养再转入平板培养,观察影响性腺发育的视黄酸(RA)、FSH、HCG对FBMSCs增殖、分化、形成卵泡样结构的影响,测定特异细胞标志和性激素,判断是否产生有功能的卵泡和卵母细胞。本研究观察到:1.第二代传代FBMSCs表达CD44、CD71,不表达CD34、CD45。2.悬滴培养3天转平板培养,获得长期培养不断增殖、分化的细胞团。3.以加入20%胎牛血清的DMEM培养液为基本培液,4周内对照组与加入RA、FSH、HCG对FBMSCs都有增殖、分化、形成细胞团,4周后RA组细胞团和细胞数减少,FSH、HCG与对照组FBMSCs继续增殖、分化、形成更大细胞团和卵泡样结构,有卵母细胞样细胞排出(64天)。4.用RT-PCR和Real Time PCR法测定对照组、RA、FSH、HCG组FBMSCs，都有Stra8、Oct4、C-kit、Vasa、SCP3、ZP3、GDF-9、FSHR、Follistatin、P450arom、LHR、P450scc表达,免疫细胞化学测定4组FBMSCs都有SCP3、FSHR、LHR、ZP3阳性细胞，Western blot测定4组FBMSCs都有SCP3、FSHR、ZP3蛋白质,表明FBMSCs向卵母细胞样细胞、颗粒细胞样细胞、卵泡膜细胞分化。5.两批次用放射免疫法测定4组培养液性激素浓度,第一批测0天、悬滴转平板培养后4组1、3、5、7、10、14、18、21、28、37、43天,雌二醇在21-43天4组都有明显增加,雄烯二酮和睾酮在10-21天、孕酮在5-7天4组都有明显减少,第二批测0天、30、48、64天4组培养液的性激素浓度,雌二醇在48、64天而雄烯二酮和睾酮在30-64天4组都有明显增加,孕酮无明显变化。结果表明悬滴培养转入平板培养的4组FBMSCs均可形成卵泡样结构和有卵母细胞样细胞从中排出,均可诱导分化为卵母细胞样细胞、颗粒细胞样细胞、卵泡膜细胞,并可合成、分泌性激素,产生有一定功能的卵泡样结构。本研究为形成人造卵巢研究奠定基础。