骨髓间充质干细胞与软骨细胞共培养中相互作用的机制研究

软骨组织工程中常用的种子细胞是成熟软骨细胞和骨髓间充质干细胞（BMSCs），软骨细胞和BMSCs共培养可以使细胞间互相影响、扬长避短发挥各自的优点，二者共培养构建的组织工程软骨已经显示出独特的优势。共培养的软骨细胞和BMSCs可能通过直接接触、细胞因子旁分泌等方式相互影响，但二者相互作用的具体方式目前仍不清楚。本课题中我们首先采用半透膜分隔培养、交换培养液培养等方法探讨直接接触、细胞因子旁分泌在BMSCs与软骨细胞共培养中的作用,确定共培养时发挥主要作用的效应细胞。再采用RNA干扰技术（RNAi）沉默BMSCs、软骨细胞中细胞因子的表达，探索共培养中细胞因子的作用。本课题对揭示共培养的软骨细胞和BMSCs间的相互作用机制有重要意义，为体外应用BMSCs和软骨细胞共培养构建高质量的组织工程软骨提供基础。

我们首先探讨了骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）和关节软骨细胞（articular chondrocytes，ACs）共培养能否促进软骨细胞外基质的表达及两种细胞共培养的最佳比例。结果显示共培养组aggrecan 和COL2的表达量在7天、14天和21天时呈现出明显的增长趋势。方差分析显示在第21天时2:1 组的COL2和aggrecan在mRNA水平和蛋白水平表达都高于单纯关节软骨细胞组和BMSCs 诱导组（P<0.05）。通过上述结果表明，将ACs和MSCs混合培养，能够明显促进软骨细胞外基质的表达，且软骨细胞和骨髓间充质干细胞2:1组具有最佳的效果。. 第二部分我们探讨了在共培养系统中ACs与BMSCs之间的相互作用机制。采用实时定量RT-PCR和Western Blot检测SOX9、COL2、Aggrecan、COL10和COL1的表达变化。直接接触共培养的ACs的表达量明显高于间接接触共培养的ACs的表达量；直接接触共培养的BMSCs的表达量也明显高于间接接触共培养的BMSCs的表达量。在直接接触和间接接触两种共培养方式中，BMSCs的SOX9、COL2和Aggrecan的mRNA和蛋白表达量均远远低于同一共培养系统中ACs的表达量，甚至仍低于单纯培养的ACs的表达量。这表明与ACs对BMSCs的诱导作用相比，BMSCs对ACs的促进和支持对于增强软骨基质形成起着更加重要的作用。与可溶性因子的作用相比，直接物理接触在共培养过程中起主导作用，至少是非常重要的作用。. 最后采用RNA干扰技术（RNAi）沉默BMSCs中TGF-β的表达，探索共培养中细胞因子的作用。与对照组相比，共培养组的软骨细胞中aggrecan、COL2的表达均较高；而干扰组软骨细胞中aggrecan、COL2的表达低于共培养组，略高于对照组，说明TGF-β在共培养中发挥了重要作用。