EGF对肝刺激因子转录调节机制的研究

肝刺激因子（HSS），又称为肝再生增强因子（ALR），作为一种肝细胞源性的生长因子，因为在肝再生中所起的重要作用而倍受关注。但从基因的转录调控到基因功能再到蛋白质相互作用等多角度来分析，有关HSS调节的分子机制尚不明了。本实验利用在肝再生中起重要作用的表皮生长因子（EGF）处理HepG2细胞，观察HSS的表达变化，通过启动子删除、报告基因分析、定点突变等实验，测定可能存在的受EGF诱导的顺式作用元件；利用凝胶电泳阻滞实验（EMSA），super-shift和染色质免疫沉淀实验证实转录因子的存在。同时确定EGF诱导HSS表达变化的信号通路。并且利用RNA干扰技术，评价HSS消减后对EGFR活性的影响。最后通过建立动物模型，阐明肝再生进程中生长因子之间的相互作用对其的影响，为全面认识这一具有重要功能的基因打下科学基础。

肝刺激因子（HSS），又称为肝再生增强因子（ALR），作为一种肝细胞源性的生长因子，因在肝再生中所起的重要作用而倍受关注。然而从基因的转录调控到基因功能再到蛋白质相互作用等多角度来分析，有关HSS调节的分子机制尚不明了。本课题利用在肝再生中起重要作用的表皮生长因子（EGF）处理肝细胞，观察HSS的表达变化，通过启动子删除、报告基因分析、定点突变等实验，测定可能存在受EGF诱导的顺式作用元件；利用凝胶电泳阻滞实验（EMSA），和染色质免疫沉淀（ChIP）实验证实转录因子的存在。同时确定EGF诱导HSS表达变化的信号通路。并且利用RNA干扰技术，评价HSS消减后对EGFR活性的影响。最后通过建立动物模型，阐明肝再生进程中EGF及相关的转录因子对其表达的影响。结果表明EGF处理细胞后HSS表达明显下调且具有浓度和时间依赖性。荧光素酶活性分析显示EGF可抑制HSS的启动子活性，说明这种抑制作用发生在转录水平。转染含有不同突变位点的pGL3-hHSS promoter质粒实验显示，HSS启动子内的C/EBP2位点在EGF介导的HSS表达下调中起着关键的作用。EMSA实验结果表明转录因子C/EBPbeta在体外与C/EBP2位点相互结合。ChIP结果也证实了在HepG2细胞内C/EBPbeta在EGF刺激下与C/EBP2位点可以相互结合。随后的转染实验表明，C/EBPbeta过表达可增强EGF的抑制作用而C/EBPbeta表达下调则可逆转EGF的作用，说明C/EBPbeta直接参与EGF对HSS的转录调节过程。在应用不同的激酶抑制剂和转染不同的siRNA后，发现EGF可以激活JNK1激酶通路，活化C/EBPbeta调节HSS的表达。制备小鼠肝脏大部分切除术（PH）后肝再生模型，HSS在PH后12h表达出现明显下降。于此同时，利用ELISA的方法对血清中EGF的浓度进行检测，发现EGF浓度在PH后6h达到高峰，与HSS的表达变化呈现负相关。最后ChIP实验显示在小鼠肝脏内C/EBPbeta可以与HSS启动子区域相关位点结合，并且这种结合在PH后12h达到最大，说明肝再生早期C/EBPbeta的活化是HSS表达下降的原因。本课题确定了EGF对HSS的转录调节机制，首次探索了肝再生后EGF、C/EBPbeta与HSS表达的关系，为全面认识这一重要基因在肝再生中的作用提供新的理论依据。