hetZ基因调控丝状固氮蓝细菌细胞分化的机理

N2-fixing cyanobacteria are oxygenic photosynthetic prokaryotes that perform nitrogen fixation. Some groups of filamentous species can produce specialized nitrogen-fixing cells, called heterocysts. Anabaena sp. PCC 7120 is the most often used research model for heterocyst differentiation. hetZ, a gene reported by our group, plays an important role in early heterocyst differentiation. It is directly regulated HetR, the master regulator of heterocyst differentiation. This proposal describes our plan to investigate the mechanism for hetZ to regulate heterocyst differentiation, including how hetZ affects the following gene expression in early heterocyst differentiation, and the relationship of hetZ to hetP, another important gene directly regulated by HetR. Strains of gene inactivation, overexpression or combinations of mutations will be constructed and used to analyze the relationship between genes. Comparative transcriptomic analyses of the wild type/hetZ-null mutant/hetZ-overexpression strain will be performed to find out genes whose expression is affected by hetZ, of which those directly regulated by HetZ will be further identified.

固氮蓝细菌是既能进行固氮作用又能进行放氧光合作用的原核生物，其中有些丝状种类可以分化产生特化的固氮细胞，称为异形胞。鱼腥蓝细菌PCC7120是异形胞分化常用的研究模式。hetZ是本实验室发现的参与异形胞分化的重要基因，受主调控因子HetR的直接调控。本项申请拟对hetZ调控异形胞分化的机理进行研究，弄清hetZ如何调控分化过程中后续的基因表达，以及hetZ与另一个受HetR直接调控的基因hetP在功能上的关系。利用基因突变、过表达及其组合分析基因之间的关系；利用转录组学方法比较突变株、过表达株与野生型，找到受hetZ影响的基因，并进一步筛选受HetZ直接调控的基因。

HetR/RGSGR调控系统在鱼腥藻异形胞分化和格式形成中起重要作用。patS编码一个含有RGSGR序列的成形素前体小肽，HetR是该基因表达所需要的。HetR还调控异形胞分化需要的两个基因hetP 和 hetZ。在本项目中，我们研究了hetZ 和 hetP的功能关系以及HetZ对于patS表达的作用。以ntcA启动子（该基因编码一个广泛的氮代谢调控因子）共表达hetZ 和 hetP可使hetR突变株形成具有较低固氮活性的异形胞。在hetP突变株过表达hetZ可恢复其异形胞分化，反之亦然。RNA-seq分析显示，许多参与异形胞分化的基因的上调表达（除ntcA和hetR以外）都既依赖hetZ也依赖hetP，但是patS的表达只依赖hetZ不依赖hetP。在鱼腥藻中失活hetZ可显著降低patS的表达，而失活patU3基因（其编码的蛋白与HetZ相互作用）则增强patS的表达。. EMSA实验显示，重组HetZ在patS启动子有两类结合位点：I) 单链DNA片段5′末端保守序列；II) 并非保守的单链DNA位点。在鱼腥藻中对HetZ的单链DNA结合位点进行置换突变导致patS表达大幅上升。因此，HetZ的单链DNA结合活性抑制patS的表达。之前，有人提出一类保守的调控序列涉及异形胞分化过程中依赖于HetR的基因表达。利用绿色荧光蛋白基因，我们证明patS上游一个此类位点是其在异形胞分化时上调表达所需要的。在同一区域恰好也有HetZ的II型单链DNA结合位点。HetZ对该区域单链DNA的结合抑制了patS的表达。另一方面，在hetZ的3’端插入转座子可导致patS基因表达水平的大幅降低。hetZ的3’端编码一个预测具有类似转录因子功能的区域。这一结果提示，HetZ的C端区域可能直接或间接地通过patS上游保守调控序列调节patS的表达。显然，HetZ对于patS有双重调节功能，其负调控服从于正调控。. 本项研究首次在原核生物发现一种特异识别位点的单链DNA结合蛋白具有调控基因表达的功能。基于这些发现以及之前的报道，我们还提出了控制异形胞分化的的HetR-HetZ-PatS调控回路。..