FasL在椎间盘免疫赦免缺失调控中作用的实验研究

椎间盘退变是困扰广大患者的一种常见病，其发病机理与椎间盘组织的免疫赦免状态被打破有关，具体分子机制尚不清楚。FasL-Fas相互作用参与机体免疫赦免的形成及维持。FasL表达于人椎间盘髓核细胞，可能与椎间盘退变相关。本研究拟在前期研究的基础上，借由人椎间盘髓核细胞和免疫细胞体外共培养的细胞模型，通过RNAi及腺病毒感染的方法，下调或上调FasL表达，观察髓核细胞，巨噬细胞，T淋巴细胞表形的变化，检测髓核细胞外基质的变化，阐明FasL在髓核细胞与免疫细胞相互作用过程中的关键地位；在此基础上，研究Caspase、Bcl体系在介导FasL对髓核浸润免疫细胞杀伤效应的意义，探讨FasL参与维持椎间盘髓核免疫赦免的分子机制；构建FasL腺病毒载体，感染椎间盘退变兔髓核细胞，以影像学及形态学指标检测兔椎间盘退变程度，初步尝试基于FasL的基因治疗策略，为椎间盘退变的治疗提供一种新思路和理论依据。

椎间盘退变是骨科常见疾病，是一系列脊柱退行性疾病的病理基础。椎间盘髓核被软骨终板以及纤维环所包绕，无血管，不与机体的免疫系统接触，其中心髓核含有多种自体抗原，是一个免疫赦免器官。当其免疫赦免破坏时，会造成自体免疫反应，引起或加重椎间盘退变。近年来，医学界逐步重视研究椎间盘髓核免疫赦免状态与椎间盘退变的关系。FasL作为体内维持免疫系统平衡的关键分子，其与Fas的结合可导致免疫细胞凋亡。本研究主要围绕可能参与髓核细胞与免疫细胞相互作用的关键分子FasL-Fas，探讨椎间盘免疫赦免缺失的分子机制。本研究首先明确了FasL在人椎间盘髓核细胞的表达，结果发现，退变髓核细胞的FasL表达量较正常髓核细胞有显著降低。在通过慢病毒转染上调退变髓核细胞的FasL表达后，通过人髓核细胞和人外周血免疫细胞的共培养发现，髓核细胞所表达的FasL 可显著增加免疫细胞（巨噬细胞和CD8+T细胞）凋亡。同时，我们也建立了髓核细胞与血管内皮细胞的共培养模型，并发现髓核细胞表达的FasL可明显诱导血管内皮细胞的凋亡，提示FasL在维持椎间盘无血管状态，阻断免疫细胞的浸润途径发挥重要作用，进一步阐明了FasL在椎间盘免疫赦免中的重要作。此外，我们发现，可溶性的FasL在髓核细胞培养液中有阳性表达，并首次发现可溶性FasL在退变椎间盘髓核细胞中表达降低，而可溶性Fas在退变椎间盘髓核细胞中表达升高。最后，我们通过建立纤维环穿刺法诱导椎间盘退变的动物模型，通过病毒转染上调其髓核FasL表达，发现FasL可通过重建椎间盘免疫赦免平衡，减轻退变椎间盘自体免疫反应，并减缓椎间盘退变进程。在以上研究基础上，我们进行了椎间盘退变在免疫调节治疗的探讨和总结，并发表相关的医学设想和综述。另外，我们也在实验中对椎间盘退变研究得到了其他新成果，发现细胞骨架蛋白成分人角蛋白8（CK8）在退变髓核细胞中随退变表达降低，同时，首次发现压力培养所导致的CK8磷酸化是其表达降低的重要原因。另外，建立了脂肪干细胞和髓核细胞的共培养体系，首次发现二者接触性共培养后，脂肪干细胞可向髓核细胞特异性分化，并且可保护髓核细胞在高压培养下的退变。以上的结果显示，FasL在椎间盘免疫赦免维持中发挥了重要作用，为将来椎间盘退变在免疫学治疗中提供了新的研究思路。