miRNAs对UVB致细胞G2/M期阻滞时p53和14-3-3σ相互调控通路的调节作用及其机制

The enhanced ultraviolet（UV）radiation (especially UVB) on the earth's surface caused by the depletion of the ozne layer results in the destruction of the living environment and the increased morbidity of skin cancer, cataract and so on, therefore more and more research works have been focused on the mechanism of UVB biological effects in recent years. This project is planned, on the basis of preliminary works, to study the regulaton role of miRNAs in the reciprocal modulation between p53 and 14-3-3σ in the G2/M phase arrest induced by UVB irradiation. The main contents include: ①To understand the reciprocal modulation between p53 and 14-3-3σ in the UVB induced human epidermal cells' G2/M phase arrest by using cell lines that overexpression or knockdown of some genes and realtime PCR, etc.. ②To establish the relationship between selected miRNAs such as miR-365 and the reciprocal modulation between p53 and 14-3-3σin the UVB induced G2/M phase arrest by dual luciferase reproter system, gene complementation tests and Co-IP, etc.. ③To varify the other miRNAs in the reciprocal modulation between p53 and 14-3-3 σ such as miR-513a-5p etc. and thus improve their regulatory network. The project has important theoretical and practical significance in the study of UVB' s cell injury and its protection.

大气臭氧层的破坏使照射到地球表面的紫外辐射（尤其是UVB）增加，导致人类皮肤癌、白内障等疾病的发病率升高和生存环境的破坏。因此，对于UVB生物学效应机制的研究近年来成为一个热点。本项目拟在前期工作的基础上，研究miRNAs对UVB诱导的人表皮细胞G2/M期阻滞中p53和14-3-3σ相互调控通路的调节作用。主要包括：①利用干扰或过表达的细胞株和荧光实时定量 PCR等以明确UVB诱导的G2/M期阻滞中，p53和14-3-3σ的相互关系；②通过双荧光素酶报告系统、基因互补实验和免疫共沉淀等方法，确立选定的miRNAs如miR-365等对UVB诱导G2/M期阻滞时p53和14-3-3σ相互调控通路的作用机制；③信息学分析存在于p53和14-3-3σ调控通路之间的其它miRNAs分子如miR-513a-5p等并完善其调控网络。本项目对于深入研究UVB的细胞损伤机制及其防护具有重要的理论和实际意义。

该课题的主要研究内容为在明确p53和14-3-3σ在细胞G2/M期阻滞中的作用基础上，研究感兴趣的miRNAs对p53和14-3-3σ相互调控的作用及其机制，并通过信息学分析完善其网络系统。.CCK、流式细胞术等证实UVB照射能引起HaCaT增殖能力下降，发生G2/M期阻滞，western的结果证明，在该过程中p53和14-3-3σ的表达量均出现升高，而UVB诱导的14-3-3σ表达的升高是引起细胞G2/M期阻滞的主要因素，升高后的14-3-3σ可通过维持较低的Cdc2的表达水平以及照后迅速降低cyclinB1和Cdc25C的水平来发挥作用。.q-PCR证实了HaCaT细胞在UVB照射后，miR-365的表达量升高，且其表达量的改变能影响p53和14-3-3σ的表达，上调或下调p53和14-3-3σ的表达又能影响miR-365的表达，这说明miR-365是p53和14-3-3σ信号通路上一个重要的miRNA。基于此我们用荧光原位杂交、免疫共沉淀、克隆形成实验、凝胶迁移实验等详细研究了miR-365的生物学功能，主要内容包括分析HaCaT细胞和皮肤鳞癌细胞株中、鳞癌组织标本中miR-365的表达，miR-365的表达对细胞增殖能力、侵袭能力、迁移能力等的影响，并探讨了其可能的下游信号通路，以及裸鼠成瘤情况。结果显示miR-365在鳞癌细胞株和临床样本中均表达增强，上调HaCaT细胞中miR-365的变化能使裸鼠体内成瘤，而下调A431细胞中miR-365的表达，则能使已成瘤的肿瘤缩小；miR-365是通过降低NFIB的表达，从而较少了NFIB与其下游的CDK4和CDK6的启动子结合并因此上调他们表达，上调表达的DK4和CDk6又能促进p-Rb的表达而发挥作用。在UVB辐射敏感的miR-664的研究方面证实了miR-664抑制皮肤恶性黑色素瘤细胞的增殖机制。.生物信息学分析完善p53和14-3-3σ相互调控通路。构建了50mJ/cm2的UVB照射HaCaT细胞，p53、p38、PARP1、14-3-3σ相互作用关系图和差异表达miRNAs与p53、p38、PARP1和14-3-3σ网络调控图。构建了30mJ/cm2的UVB照射后差异表达的miRNAs的聚类分析图、14-3-3σ互作的基因/蛋白图，测序结果需更深层次的挖掘，蛋白互作方式也需进一步探讨。