内质网应激蛋白GRP78表达上调在鼻咽癌放疗抵抗中的作用及其机制研究

Our previous comparative proteomic study has first shown that upregulation of GRP78, one of the protective proteins of endoplasmic reticulum stress (ERS), was related to nasopharyngeal carcinoma (NPC) radioresistance. It has been reported that ERS-induced apoptosis is one of important mechanisms for anti-cancer of radiochemotherapy. Based on the above mentions, we suppose that GRP78 overexpression is involved in NPC radioresistance through antagonizing ERS and activating prosurvival ERK-1/2 signaling pathway. Therefore, in this project we will use NPC cell lines, NPC xenografts and clinical NPC tissues with different radiosensitivity as study samples, and first establish NPC cell lines with GRP78 expressional changes to analyze the effects of GRP78 expressional changes on in vitro and in vivo NPC radiosensitivity; and then analyze the effects of GRP78 expressional changes on the ERS response and ERK-1/2 signaling pathway activity of NPC cells to determine the relationship in the ERS and ERK-1/2 signaling pathway activity and NPC radiosensitivity; finally study the NPC radiosensitization of small molecule drugs DMC (triggering ERS) and IPI-504 (decreasing GRP78 stability). Our expected data will not only be helpful to reveal the roles and molecular mechanisms of GRP78 overexpression in the NPC radioresistance, but also can provide scientific bases for clinical NPC radiosensitization.

我们前期的比较蛋白质组学研究首次发现，内质网应激（ERS）保护蛋白GRP78高表达与鼻咽癌(NPC)放疗抵抗密切相关。已有的研究表明，ERS诱导的细胞凋亡是放化疗抗肿瘤的重要机制之一。因此，我们提出GRP78高表达通过拮抗ERS以及激活促细胞生存的REK-1/2信号通路参与NPC放疗抗拒。为此，项目以放疗敏感性不同的鼻咽癌细胞系、鼻咽癌裸鼠移植瘤以及临床鼻咽癌组织为样本，首先建立GRP78表达改变的NPC细胞系，分析GRP78表达改变对体外和体内NPC放射敏感性的影响；再分析GRP78表达改变对ERS和ERK-1/2信号通路活性的影响及其与NPC放射抵抗的关系；最后研究小分子药物(触发ERS的DMC以及降低GRP78稳定性的IPI-504)的NPC放疗增敏作用。项目研究结果不仅有助于揭示GRP78高表达在NPC放疗抵抗中的作用及其机制，而且能为NPC的放疗增敏治疗提供科学依据。

鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma,NPC) 是我国南方常见的、原发于鼻咽部的一种恶性肿瘤。放疗是其首选和主要治疗措施，但放疗抗拒严重影响其疗效。NPC放疗后约35%患者有病变残存，残存癌灶重新克隆是导致NPC复发的主要原因。因此，筛选NPC放疗抗拒预警分子并揭示NPC放疗抗拒的分子机制，有望找到NPC治疗新途径。项目采用8GY射线照射C666-1，建立了NPC放疗抗拒细胞系C666-IR；应用siRNA建立了靶向干扰葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein 78KD, GRP78)的放射敏感C666-IS细胞系（C666-shGRP78）。 GRP78与配体Cripto结合后具有干细胞特性，GRP78发挥放疗抗拒及促肿瘤干性形成的作用。.miRNA芯片分析C666-IR　vs　C666-1，共获得315个差异表达miRNAs（268个上调、47个下调），并分析其靶基因，共涉及12条信号通路，其中多条信号通路相关到GRP78；miRNA芯片分析C666-IS vs C666-1, 共获得246个差异表达miRNAs（210个上调、36个下调）。最后筛选出与C666-IR放射抗拒相关且涉及GRP78表达的15个差异miRNAs。进一步分析其培养基和NPC血清表达,发现血清３个miRNAs水平与NPC抗拒密切相关;miR-15a-5p具有重要研究价值；miR-15a-5p在C666-IR细胞中低表达，与GRP78及其配体Cripto高表达呈负相关；干性相关分子Sox2和Nanog亦表达上调、干性特征增强且更具放射抗拒性；实验结果显示GRP78与Cripto形成共受体，二者定位细胞表面；双荧光素酶报告基因发现miR-15a-5p靶向GRP78配体Cripto，其低表达提高Cripto水平增强NPC抗拒。结合生物信息学及荧光素酶报告基因和Western-Blot分析，我们首次发现miR-15a-5p靶向GRP78配体Cripto。miR-15a-5p调节Cripto/GRP78，可能通过Nodal及Smad2/3或者MAPK/PI3K途径（实验验证中）抑制TGF-β信号通路，导致C666-IR损伤修复功能增强，从而使C666-IR细胞产生放射抗拒性，促干细胞特性形成而导致放疗抗拒。