耐热β-半乳糖苷酶在枯草芽孢杆菌中分泌效率的限制因素研究

来源于嗜热脂肪芽孢杆菌的耐热β-半乳糖苷酶具有热稳定性好、最适反应温度较高及良好的食品安全性等特点，非常符合乳品工业乳糖水解反应的需求。本研究团队已在枯草芽孢杆菌中通过双精氨酸分泌途径首次实现了该酶的重组分泌表达，但分泌效率较低。研究发现原因在于该酶前体加工效率较低，然而哪些因素限制了该类前体的加工效率尚未有报道。从我们的前期研究结果和前人对枯草芽孢杆菌相关分泌途径效率的研究结果得到启发，提出底物在枯草芽孢杆菌中以双精氨酸途径分泌时，前体加工效率的限制因素假设：即信号肽酶对前体的特异性、信号肽酶和转运酶在细胞体内的表达量可能是该类前体加工效率的主要限制因素。针对上述假设，分别设计实验来验证其合理性。本研究有可能揭示枯草芽孢杆菌双精氨酸分泌途径的效率限制因素，为突破双精氨酸途径分泌效率瓶颈提供参考数据，为耐热β-半乳糖苷酶分泌效率的增强提供理论基础。

枯草芽孢杆菌是具有GRAS安全性的微生物，其双精氨酸蛋白质分泌途径（Twin-arginine Translocation Pathway，Tat途径）是该菌蛋白质分泌的第二个主要途径，其特点是能够分泌输出在细胞体内已折叠的蛋白质，因此该途径具有潜在应用价值。但与蛋白质的一般分泌途径（Sec）相比，Tat途径分泌效率较低，研究哪些内在因素在何种程度上限制和影响该途径分泌效率，有可能突破枯草芽孢杆菌Tat分泌途径瓶颈，为外源折叠蛋白质的分泌提供理论参考。.本项目以食品安全的、在乳品工业有应用价值的耐热β-半乳糖苷酶作为Tat分泌效率限制因素研究的目标对象。通过研究枯草芽孢杆菌Tat分泌途径中信号肽酶的底物亲和力、信号肽酶在体内表达量及信号肽酶催化活力、转运酶的表达量这三种因素来探讨了限制蛋白质前体加工效率的主要因素。项目组首先针对研究内容构建了一系列适用于枯草芽孢杆菌Tat蛋白质分泌途径的分泌表达载体和分泌表达系统，接着构建了枯草芽孢杆菌信号肽编码序列库并以此为基础通过定点突变对信号肽切割识别位点的氨基酸残基进行了突变，从而研究了信号肽酶的底物亲和力与Tat前体加工效率之间的关系；其次通过信号肽酶的表达量控制及催化活性中心的氨基酸残基突变，研究了信号肽酶的催化活力与Tat前体加工效率的关系，最后通过对转运酶不同水平的表达研究了转运酶在细胞内的含量与前体加工效率的关系。结果表明，信号肽酶的催化活力对底物分泌效率有较大影响，而信号肽切割识别位点（-2位）氨基酸残基序列和转运酶的表达量对底物分泌效率有影响但并不显著。此外，本研究构建的多套基于Tat分泌途径的枯草芽孢杆菌分泌表达载体和重组表达菌株。.本项目的执行结果为枯草芽孢杆菌Tat分泌途径效率研究提供了新的研究材料、实验方法和工具，形成了有参考价值的数据和结论，对于以胞内酶形式存在的食品用酶的分泌表达生产具有潜在应用价值。