USP25-RPA32信号轴参与DNA同源重组修复调控肿瘤发生的机制研究

Internal and external factors cause DNA damage, if DNA damage can't be repaired, which will result in genomic instability and cancer. Homologous recombination(HR) play a key role in the maintenance of genomic stability in a variety of repair pathways. RPA is the central factor of DNA homologous recombination repair, the function of RPA is mainly regulated by post-translational modification, but the study of RPA32 deubiquitination modification has not yet been clear. In this project, our preliminary data showed that deubiquitin enzyme USP25 interacts with RPA32 and deubiquited RPA32, and knocking down USP25 can increase the level of HR, suggesting that USP25-RPA32 signaling axis may be involved in homologous recombination repair. Knockdown of USP25 promotes the proliferation of tumor cells, suggesting that the signal axis may be involved in the tumorigenesis. Based on these findings, we hypothesized that USP25-RPA32 signal axis may regulate the tumorigenesis by improving the level of HR repair. Using methods of ubiquitination and in-vitro phosphorylation, we will further investigate the molecular mechanism that how USP25 regulate DNA damage repair through RPA32 and further improve the DNA homologous recombinant repair signal network. By constructing USP25/RPA32 double knockout mice and MEF cell model, we will further confirmed important function of USP25-RPA32 signal axis in the development of tumor, and provide the theoretical basis in order to explore new targets for tumor prevention and treatment.

生物体易发生DNA损伤，如不及时修复，将导致基因组不稳定，诱发肿瘤。同源重组修复（HR）对维持基因组完整性至关重要。RPA是HR修复的中心因子，其功能通过翻译后修饰调控，但RPA去泛素化修饰机制尚不明确。前期研究发现，去泛素化酶USP25与RPA32互作并去泛素化RPA32，敲减USP25提高HR修复水平，提示USP25-RPA32信号轴参与同源重组修复；敲减USP25促进肿瘤细胞增殖，提示该信号轴参与肿瘤发展进程。由此推测：USP25-RPA32信号轴可能通过提高HR修复水平，调控肿瘤发生。本项目拟采用去泛素化、体内体外磷酸化等方法，深入探索USP25通过RPA32调控DNA损伤修复的机制，完善DNA同源重组修复信号网络；通过构建USP25/RPA32双基因敲除小鼠和MEF细胞模型，进一步证实USP25-RPA32信号轴在肿瘤发生发展中的重要功能，为探索肿瘤预防和治疗新靶点提供理论依据。

遗传物质DNA是生物体发挥功能最重要的遗传基础，保持其结构的完整性和稳定性至关重要。DNA时时刻刻都面临来自于生物体内部和外部的侵袭，从而诱导 DNA损伤，这些损伤会激活 DNA 损伤应答通路，以维持基因组稳定及保证人体器官正常工作。但是，如果DNA 损伤应答通路的功能异常，不能及时修复DNA损伤，会造成遗传物质丢失、基因重排，引起基因组不稳定，最终诱发肿瘤。DNA损伤包含了多种不同形式的损伤，其中DNA双链断裂是最为严重的损伤之一。同源重组修复（HR）对维持基因组完整性至关重要。RPA是HR修复的中心因子，其功能通过翻译后修饰调控，但RPA去泛素化修饰机制尚不明确。.本项目研究发现，去泛素化酶USP25与RPA32互作并去泛素化RPA32，敲减USP25和RPA32提高HR修复水平，降低NHEJ的修复水平，提示USP25-RPA32信号轴参与DNA损伤修复。RPA32是同源重组修复过程的关键蛋白，在进一步检测中发现，USP25敲除后，RPA32在DNA损伤处的募集能力增加，细胞对离子辐射的敏感性降低。并且在DNA损伤后，USP25敲除细胞的RPA32磷酸化水平与对照相比显著增加，说明USP25敲除促进了DNA resection，进而促进了同源重组修复。并且在IR诱导DNA损伤的细胞中，USP25能被ATM磷酸化，USP25 T523位点突变后，USP25不能继续被ATM磷酸化，发挥下游功能。利用Crispr技术，建立敲除小鼠模型，通过化学致癌诱变剂二甲基苯蒽（DMBA）和TPA涂抹小鼠皮肤诱导皮肤癌变，7个月后，对照组与USP25敲除小鼠相比，肿瘤发生比例显著提高。利用敲除小鼠模型，在将小鼠进行5gy离子辐射，在恢复48h之后，USP25小鼠小肠绒毛的长度明显好于对照组；小肠隐窝细胞的细胞凋亡减少，细胞增殖增加。最终，阐明USP25-RPA32信号轴，通过参与DNA同源重组修复调控肿瘤发生的分子机制。