丙酮丁醇梭菌产醇期电子歧化酶复合体鉴定和功能研究

As an obligate anaerobic bacterium, C. acetobutylicum is a model organism for acetone-butanol-ethanol (ABE) fermentation by a typical biphasic process in a batch fermentation. The metabolic features profiles during acidogenic and solventogenic phase are profoundly different. This shows that carbon and redox balance is reconstructed from acidogenesis to solventogenesis. According to butanol biosynthesis pathway and stoichiometry, there must be an electron bifurcating enzyme complex which transfers electron from reduced ferredoxin to NAD+ during solventogenesis. However, it is not identified and determined until now. In the present work, sulfur-limited continuous cultivation, transcriptome and conserved binding domain analysis techniques are used to primarily confirm this complex. Then, the specific activity of enzyme complex under anaerobic condition is determined and genes function is clarified using genetic tools. The transition mechanism from acidogenesis to solventogenesis and modification mechanism of butanol/acetone ratio in the end-products are still elusive in C. acetobutylicum. The clarification of this electron bifurcating enzyme complex in this study will highlight understanding of these mechanisms and provide theory basis.

丙酮丁醇梭菌是丁醇生产的模式菌株，根据产物组成，分批发酵过程分为产酸期和产醇期，是典型的酸醇双期发酵。由于合成醇类时需要消耗还原力NADH，因此由产酸期进入产醇期后，氧化还原反应进行了重新平衡。根据丁醇合成过程中碳平衡和氧化还原平衡的化学计量可以推知，在产醇期存在一个电子歧化酶复合体将还原性铁氧还蛋白的电子传递给NAD+，生成的NADH作为辅因子参与丁醇的合成。本研究采用限硫的连续发酵技术和比较转录组分析，鉴定铁氧还蛋白参与的氧化还原酶，并通过保守底物结合域分析，筛选出产醇期发挥作用的电子歧化酶复合体。最后通过厌氧纯化、酶活表征以及基因敲除/敲入认识该电子歧化酶复合体在丙酮丁醇梭菌整个代谢途径中的功能，这将为阐明产丁醇梭菌的酸醇转换机制和丁醇/丙酮比率的调控机制提供重要的理论基础。

丙酮丁醇梭菌是典型的酸醇双期发酵厌氧梭菌，分批发酵过程中，梭菌根据不断变化的发酵环境调整代谢途径和产物生成，发酵过程被人为划分为产酸期和产溶剂期，产物不同说明这两个时期具有完全不同的代谢调控机制，并且从产酸期到产溶剂期的转换过程中，氧化还原平衡（redox balance）进行了重构。通过分析丙酮丁醇梭菌在产溶剂期的产物组成及氧化还原平衡，推测存在未阐明功能的氧化还原反应，该氧化还原反应可以氧化Fdred，同时还原NAD+，进而实现产溶剂期的氧化还原平衡，维持梭菌的正常生长代谢。如果存在该氧化还原反应，一定是铁硫依赖（Ferredoxin）的氧化还原反应，通过限硫的连续发酵，使连续培养基中的硫含量处于缺乏状态，得到全基因组水平上的转录上调基因，分析基因功能，遴选出编码氧化还原酶的基因，鉴定了二氢乳清酸脱氢酶符合预期。通过连续发酵技术、分子工程技术和酶学分析技术的应用，解析了二氢乳清酸脱氢酶复合体的催化的氧化还原反应机制，结果显示，该反应只是NADH依赖的，并没有Fdred参与。但是通过突变株的连续发酵并分析产物的碳源平衡和能量平衡，发现丙酮丁醇梭菌在产酸期和产溶剂期会产生一种从未报道的糖蛋白，糖蛋白通过结构组成变化，实现了产酸期和产溶剂期的氧化还原平衡，并实现了丙酮丁醇梭菌的由产酸期到产溶剂期的转换。糖蛋白的发现和鉴定为彻底阐明丙酮丁醇梭菌的酸醇转化的发酵机制提供了坚实的实验证据。