丙酮丁醇梭菌碳代谢物调控蛋白CcpA的功能域鉴定和结构优化

Clostridium acetobutylicum is an important microbe widely used in solvent-bioproducing industry. However, it was limited in utilizing mixed carbon sources because of carbon catabolite repression (CCR). CcpA is a catabolite control protein in C. acetobutylicum. Inactivation of the CcpA could eliminate CCR, but simultaneously, markedly decreased growth rate of the strain. To split CcpA's pleiotropic functions and then specifically eliminate CCR, it is necessary to study the structure and function of this protein. C. acetobutylicum CcpA has been identified previously by our research group. In this study, we will screen for key amino acid residues of CcpA that specifically control CCR by homologous modeling-based rational design and random mutagenesis. Then, the molecular mechanism of how these amino acid residues affect CcpA function will be dissected through transcript analysis, identification of regulatory sites and functional analysis of cofactors. On this basis, saturation mutagenesis and multiple mutagenesis will be adopted to further optimize CcpA protein for getting an ideal strain phenotype. In addition, we will also explore the functional universality of these amino acid residues in all CcpA proteins of solventogenic clostridia. This study will not only contribute to understand the relationship between molecular structure and functions of CcpA, but also simplify and optimize its function, thus generating a valuable molecular element for synthetic biology-based strain modification.

丙酮丁醇梭菌是溶剂发酵工业的重要菌株。由于"碳代谢物阻遏效应"（CCR）的存在，该菌对复杂碳源的利用受到限制。CcpA是丙酮丁醇梭菌中的碳代谢物调控蛋白，其缺失可以消除CCR但同时影响菌体生长。因此有必要对该蛋白进行结构与功能的研究，进而拆分其多效作用，达到专一解除CCR的目的。本研究将通过基于结构模拟的有理设计和随机突变，筛选并鉴定CcpA蛋白中专一控制CCR效应的关键氨基酸残基。同时，结合转录谱、调控位点和辅助蛋白分析等实验，研究这些关键氨基酸残基影响CcpA调控功能的分子机制。然后，经饱和突变和叠加突变进一步优化表型，实现CcpA分子中CCR相关功能域的屏蔽。此外，还将探讨这些关键位点在其它产溶剂梭菌CcpA中的普适性。该研究将有助于理解产溶剂梭菌CcpA蛋白的分子结构及对应的功能关系，并实现该蛋白调控功能的简化和优化，为合成生物学的菌株改造提供有价值的分子元件。

CcpA（catabolite control protein A）是低GC含量革兰氏阳性细菌中介导碳分解代谢物阻遏效应（Carbon Catabolite Repression, CCR）的关键转录调控因子，在速效碳源存在时能够抑制菌体对非速效碳源的利用。由于CcpA是一个多效调控蛋白，将其敲除后虽能解除CCR效应，但亦会引起菌体的生理缺陷和代谢异常。因此，对它进行结构与功能的研究及分子的精细改造很有必要。.本项目通过对丙酮丁醇梭菌中多效调控蛋白CcpA进行结构模拟和功能域分析，结合有理和无理突变技术，获得了该蛋白的一系列与碳代谢物阻遏（CCR）调控相关的突变体。其中，CcpA第302位的缬氨酸被鉴定为参与CCR调控的关键氨基酸残基。将该缬氨酸替换为天冬酰胺（V302N）后，突变菌株在葡萄糖-木糖混合碳源发酵过程中的CCR 效应显著削弱，木糖利用能力提高，可达到85%左右，溶剂产量增加25%以上。进一步的结构模拟分析发现，CcpA蛋白V302位点的突变（V302N）很可能造成了空间位阻，影响其与辅助蛋白HPr-Ser46-P的结合，进而阻碍了调控功能的发挥。随后的比较转录谱分析和凝胶阻滞等实验，在分子水平揭示了上述氨基酸残基突变对CcpA 结构和下游调控途径的影响，以及相关的作用机制。此外，通过对厚壁菌门中另一株菌——枯草芽孢杆菌中CcpA的相应位点进行突变（V301N），得到了与上述结果相似的表型，提示该机制具有一定的普适性。综上所述，本研究揭示了丙酮丁醇梭菌CcpA蛋白中与CCR效应相关的关键氨基酸位点，并通过对该位点的精细改造优化了CcpA的功能，为丙酮丁醇梭菌的代谢工程改造提供了新的线索和策略。.本项目发表论文6篇，培养研究生2名，按计划完成了任务。