miR-370和EGFR低甲基化调节EGFR信号通路在肺癌血管生成和肿瘤形成中的作用机制

The epidermal growth factor receptor (EGFR) signaling plays an important role in molecular target therapy of lung cancer，but the regulatory mechanism of the expression of EGFR is not clear. Our previous study showed that miR-370 and EGFR gene hypomethylation may play an important role in EGFR protein expression. Therefore, we assume that low miR-370 expression, EGFR gene methylation status may be the cause of EGFR overexpression, and between the two there is some correlation. On the basis of our previous work, this project is aim to determine whether whether miR-370 directly targets EGFR atcellular and tissue level，and study the correlation between the expression level of miR-370/EGFR and clinical staging, pathological type, and prognosis. Furthermore, we will study the molecular biological function and mechanism of miR-370 and EGFR overexpression in vitro and in vivo, and clarify its complex role in lung cancer angiogenesis and tumorigenesis to provide the evidence of EGFR as a novel target for miR-370 in tumor angiogenesis-related signal transduction, and to provide a theoretical basis for the molecular mechanism of carcinogenesis and development of lung cancer and the therapeutic use of miR-370.

以表皮生长因子受体(EGFR)信号通路为基础的分子靶向治疗在肺癌治疗中发挥着重要作用，但EGFR表达调控机制尚不清楚。我们前期研究发现miR-370和EGFR基因低甲基化影响EGFR蛋白表达。因此，我们假设miR-370低表达、EGFR基因低甲基化可能是导致EGFR过表达的主要原因，且两者间有一定相关性。本项目拟在细胞和组织水平验证EGFR是否是miR-370的靶基因，分析miR-370、EGFR启动子低甲基化的表达水平与肺癌临床分期、病理分型、预后的相关性，通过体内、外实验研究miR-370和EGFR基因低甲基化的分子生物学功能及对EGFR基因表达调控的分子机制，阐明miR-370和EGFR在肺癌血管生成和肿瘤形成中的作用机制，探索miR-370新的作用靶点及其与肿瘤血管生成相关的信号通路机制，为肺癌发生发展的分子机理研究提供理论依据，为下一步开发利用miR-370进行靶向治疗奠定基础.

肺癌的死亡率一直位列肿瘤死亡率之首，对人类健康造成巨大的危害。晚期肺癌患者缺乏有效治疗，预后改善不显著，亟需对其生物学特性进行深入的研究并寻找新的治疗策略。而microRNA以及甲基化是目前令人关注的两种基因调控新型策略。本研究运用Targetscan等网站预测EGFR有miR-370结合位点；运用实时定量PCR检测发现肺癌组织的miR-370低表达，EGFR呈高表达，二者呈负相关。用双荧光素酶实验证实miR-370可以结合EGFR 3’UTR。以western-blot及甲基化PCR法检测发现肺癌组织的EGFR蛋白呈高表达且与转移相关，EGFR蛋白表达与DNA甲基化有关。转染miR-370 mimics降低了H157、XWLC-05细胞中EGFR蛋白的表达，抑制了增殖、迁移、克隆形成及侵袭能力；削弱AKT、ERK的磷酸化水平及HIF-1α的表达，转染miR-370 inhibitor增强了EGFR的蛋白表达，显著促进了H157、XWLC-05肺癌细胞的增殖、迁移、克隆形成及侵袭能力，并增加AKT、ERK的磷酸化水平及HIF-1α的表达。成功建立miR-370高表达的XWLC-05细胞株miR-370- XWLC-05，并进行了功能验证；构建皮下移植瘤模型，与阴性对照组相比，miR-370高表达的实验组小鼠皮下移植瘤增长趋势明显受到抑制；miR-370组小鼠离体肿瘤的重量显著低于阴性对照组；免疫组织化学染色显示：EGFR、Ki-67和HIF-1α蛋白以及微血管密度（MVD）在miR-370组细胞中的表达显著低于对照组；转移瘤模型中miR-370组微转移评分低于对照组。注射miR-370 mimics的实验中，实验组小鼠皮下移植瘤增长趋势明显受到抑制，实验组肿瘤小于对照组肿瘤大小，差异有统计学意义。实验组小鼠离体肿瘤的重量显著低于对照组；免疫组织化学染色显示实验组EGFR、HIF-1α、Ki-67表达及微血管密度显著低于对照组。而在转移瘤模型中，实验组的转移瘤评分低于对照组。本研究首次证实了miR-370在肺腺癌细胞中可以结合EGFR3’UTR，调控EGFR的表达；通过抑制AKT、ERK信号通路活化，降低HIF-1α的表达；从而抑制肺腺癌生长，血管生成及转移。EGFR同时受到DNA甲基化的调节，为肺癌发生发展的分子机理提供了理论依据，同时为开发新的治疗策略提供了理论基