草地早熟禾耐热性相关分子标记筛选

Kentucky bluegrass (Poa pratensis L.)(KBG) is one of the widely cultivated cool season turfgrass and forage in temperate regions of the world. Heat stress caused the decline of turf quality and sod forming ability. The complex genetic background and facultative apomictic system cause the heat tolerance breeding of KBG more difficult. Combined with the results of Photochemical efficiency (Fv/Fm), content of chlorophyll, electrolyte leakage of cell membrane of leaves and the polymorphism of the markers selected in the individual plant from related populations under artificial heat stress, we will choose the heat-tolerant and heat-sensitive clones to construct two gene pools. Simple sequence repeat (SSR) and Sequence-related amplified polymorphism (SRAP) will be used in the polymorphism selection between these pools. And these selected markers would be tested in some more Kentucky bluegrass germplasms. We believe that with combined markers used in the future, better efficiency is likely to be achieved in heat tolerance selection in KBG. Moreover, through the sequence alignment of these amplified fragments on the net, genes related to heat tolerance would be predicted.

草地早熟禾是温带地区应用最广泛的优质草坪草和牧草之一。但作为冷季型草，它时常会遭受高温的胁迫，致使品质和成坪能力降低，因此选育耐热品种成为其主要的育种方向之一。草地早熟禾本身具有极其复杂的遗传背景和独特的兼性单性繁殖方式，加之耐热性是一个由多基因控制的复杂性状，这些使得对该作物耐热性的研究工作无法深入。本项目通过人工高温处理，对候选无性系群体进行叶绿素光化效率（Fv/Fm）、电导率（EL）、叶绿素含量的检测，并结合目测评分结果综合评判单株的耐热性。据此，构建耐热和不耐热无性系的基因池，再使用简单序列重复（SSR）和相关序列扩增多态性（SRAP）标记对池进行多态性筛选。获得的多态性分子标记将在另收集的一批草地早熟禾材料中进行验证。通过分析后，这些筛选获得的分子标记将被组合使用，试应用于草地早熟禾的耐热性鉴定。同时，扩增片段序列将与网上数据库进行比对，预测可能与耐热性相关的基因信息。

作为一种优质的冷季型草坪草，草地早熟禾在我国面临日益严重的夏季高温胁迫。但草地早熟禾的繁殖方式和遗传背景都十分复杂，很难利用常规研究方法进行深入高效的耐热性育种和研究，因此本项目以分子标记为切入口，来寻找与草地早熟禾耐热性相关的基因。.研究搜集了一批国内外选育的品种和野生材料，对它们进行了表型考察和分子水平的遗传多样性分析，结果显示这些材料遗传背景较为丰富。接着，在人工气候室内进行了近两个月的40℃高温胁迫，将近千株材料进行了耐热性的排序，并通过304对SRAP引物和88对SSR引物对极端耐热和不耐热的各15个单株进行筛选，寻找出差异条带。然后将这些条带进行转化，并在群体中进行鉴定，最终获得12个与耐热性相关的SCAR标记，但并未发现这些多态性条带的序列与已报道的耐热性或其它抗逆性基因有关。联合使用S-me8×em2 和 S-me52×em5 标记，将大大提高对不耐热材料的选择效率。为了能更有的放矢的找到与草地早熟禾耐热性有关的基因，研究增加了热胁迫下 RNA 测序工作，对野生材料‘宁兰’（越夏性弱）和国内栽培品种‘KBG03’（越夏性强）进行常温和热胁迫下转录组的测序和比对。通过De novo拼接共得到11万多个unigenes，平均长度1100bp，比对发现与草地早熟禾最接近的物种是二穗短柄草。热胁迫后，包括热激蛋白在内的大量基因表达量发生变化，短时热胁迫多于长时热胁迫，‘宁兰’多于‘KBG03’。耐热相关基因的数据挖掘还在进行中。同时，半数搜集材料还进行了两年的田间成坪实验，结果表明材料间存在越夏性差异，此外越夏性和耐热性并不完全一致，可见越夏性是一个极其复杂的性状。因此又增加了夏季田间干旱和强光照的胁迫实验，两个胁迫因子会大大加重夏季的胁迫程度，但并非造成这些材料在本地区越夏性差异的原因。.本项目研究结果为草地早熟禾不耐热材料的鉴定提供了稳定快捷的分子标记，还对本地区夏季草地早熟禾田间养护管理提出了建议。同时获得的大量DNA和RNA水平的耐热性相关片段信息，将为后续开展草地早熟禾耐热基因挖掘和研究打下良好基础。