草地早熟禾种间体细胞杂交的研究

草地早熟禾是一种品质和抗逆性优良的草坪草种，其常以兼性无融合生殖方式进行繁殖，有些品种无融合生殖率高达98%以上，但有性杂交率很低。本项目针对草地早熟禾在自然杂交上的难点，利用甘肃省早熟禾野生种质资源优势，分别以草地早熟禾野生品种和商用品种为供试材料，进行其原生质体的培养。在此基础上采用PEG融合法和电融合法开展草地早熟禾种间体细胞杂交的研究，试图将甘肃本土野生早熟禾品种的优良遗传性状转移到商用品种－午夜2号和新歌莱德中，育成抗逆、抗病或坪用性状优良的本土复合型草地早熟禾体细胞杂种新品系（种）。通过本项目的实施可探索和整理出原生质体培养和体细胞杂交技术在草地早熟禾中应用的适宜的方法和技术突破点，提出成熟完善的草地早熟禾原生质体培养和体细胞杂交的技术体系和指标，探明获取草地早熟禾体细胞杂种的有效途径和方式。本项目的完成将是生物技术在早熟禾育种研究中的尝试和突破，具有重要的科学意义和研究价值。

针对草地早熟禾有性杂交障碍，本项目以具有优良性状的甘肃野生草地早熟禾和商用草地早熟禾品种为亲本，进行了体细胞杂交的研究，取得的主要研究结果是：（1）采集了甘肃境内8份野生草地早熟禾种质材料，从表型和生理层面上进行了其萌发期和苗期的抗旱性评价，筛选出具有较强抗旱性的种质2份，分别是LX（陇西野生草地早熟禾）和AD（定西安定野生草地早熟禾）。研究了其愈伤组织的诱导和分化能力，AD具有更高的愈伤组织诱导率（67%）和体细胞胚的形成率（63.29%），更适合作为体细胞杂交的亲本材料。（2）建立了AD原生质体培养再生体系，其原生质体游离的最适条件是：1.5%纤维素酶R-10+0.5%果胶酶Y-23+1%离析酶R-10+0.3%崩溃酶，酶溶剂为添加了0.50mol·L-1甘露醇的CPW盐溶液，酶解16h，酶解液pH为5.5，温度为28℃，此条件下原生质体的产量和活力分别可达到6.03×106 个·g-1和85.3%； AD原生质体培养的最佳培养密度为3×105个·mL-1，2,4-D浓度为1.0 mg·L-1，培养方式为液体浅层静置培养，此条件下细胞分裂频率和植板率分别可达到9.56%和4.62%。（3）对PEG法和电融合法的融合条件进行了一定的探索，PEG最佳的作用浓度为35%，最佳作用时间为20min，其融合率最高可达到9.7%；电融合的最佳条件为：交流场强为20 V/cm，交流频率为2000 kHz，脉冲强度为200 V/cm，幅宽为40μs，脉冲次数为3次；融合所需最适的原生质体密度为3×105个/mL，其融合率最高可达到25.39%。（4）应用代谢互补选择法来对草地早熟禾杂种细胞进行筛选，5 mmol·L-1的IOA处理10min为W-2原生质体钝化的适宜条件；40µg·ml-1的R-6G处理15min为AD原生质体钝化的适宜条件。（5）融合后的原生质体经培养后共再生出21株再生苗，通过同工酶和RAPD分析，确定了13株体细胞杂种植株。. 本研究筛选出了2份抗旱性较好的野生草地早熟禾种质，可作为良好的育种材料。建立了完善的草地早熟禾原生质体培养、原生质体融合和杂种细胞筛选体系，为草地早熟禾体细胞杂交育种奠定了良好的研究基础。同时，本项目初步阐明了草地早熟禾无融合生殖特征，为草地早熟禾杂种性状的稳定遗传指明了途径。