CCAAT增强子结合蛋白同源蛋白在多聚谷氨酰胺疾病分子发病机制中的作用

The study of the pathogenesis of polyglutamine (polyQs) diseases caused by Single-gene mutation is an international research focus on neurology. Recent studies found the endoplasmic reticulum stress (ER stress) and the unfolded protein response (UPR) are early events in PolyQs diseases. Based on our findings that transcriptional and protein levels of CCAAT enhancing binding protein homologous protein (CHOP),a transcriptional facor, are elevated in PolyQs induced ER stress and UPR and accumulated dramatically in the nuclear, this project aims to study possible upstream regulatory mechanism underlying the elevated CHOP mRNA level in response to PolyQs proteins, the effect of PolyQs on the transcriptional activity of CHOP and the possible underlying mechanisms as well as the effects of polyQs protein on CHOP-induced apoptotic pathway in Huntington's disease (HD) and spinocerebellar ataxia type 3 (SCA3) cell models by using gene transfection, luciferase reporter gene detection, co-immunoprecipitation, chromatin immunoprecipitation, immunofluorescence, lightCycler PCR and sub-cellular components analysis.The project also aims to study the possible rescue effects of down regulation of CHOP by using CHOP siRNA on cytotoxicity of polyQ proteins.

单基因变异导致的多聚谷氨酰胺（PolyQs）疾病发病机制的研究是国际上神经病学的研究热点。近期研究发现内质网应激和未折叠蛋白反应是PolyQs病早期事件,本课题基于申请人前期研究发现转录因子CCAAT增强子结合蛋白同源蛋白（CHOP）的转录及蛋白水平在PolyQs诱导的内质网应激和未折叠蛋白反应中明显升高，并在细胞核内大量聚集的结果，通过亨廷顿舞蹈病（HD）和脊髓小脑共济失调3型（SCA3）的细胞模型,运用荧光素酶报告基因检测、免疫共沉淀、染色质免疫沉淀、免疫荧光、lightCycler PCR、亚细胞成分分析来研究变异PolyQs蛋白对CHOP转录水平增高的上游调控机制，PolyQs对CHOP转录活性的影响及其可能机制，以及PolyQs蛋白对CHOP诱导的凋亡通路作用的影响。应用外源性转染CHOP siRNA干预方法结合电镜技术，研究下调CHOP水平可能减轻变异POlyQs蛋白毒性作用。

单基因变异导致的多聚谷氨酰胺（PolyQs）疾病发病机制的研究是国际上神经病学的研究热点。异常扩增的PolyQs片断能导致至少9种遗传性神经变性疾病，包括亨廷顿舞蹈病（HD）。PolyQs片断细胞毒性的分子机制尚不明确。目前认为转录调节异常、内质网应激和未折叠蛋白反应在PolyQs疾病分子发病机制中起重要作用。本课题研究发现PolyQs片断和变异亨廷顿蛋白的一个新的靶蛋白，重要的应激诱导的转录激活因子――CCAAT增签字结合蛋白同源蛋白（CHOP），同时运用荧光素酶报告基因检测、免疫共沉淀、染色质免疫共沉淀、免疫荧光、lightCycler PCR和亚细胞成分分析来研究变异PolyQs和亨廷顿蛋白对影响CHOP转录水平及其转录调节活性的可能分子机制。CHOP在应激诱导的转录调节、内质网应激和未折叠蛋白反应中均起重要调节作用。研究发现变异PolyQs蛋白和变异htt 蛋白显著增加CHOP mRNA转录水平和蛋白表达水平，变异亨廷顿蛋白在包涵体形成之前已经显著增加CHOP表达水平。重要的是，在HD患者的脑组织中也发现CHOP蛋白表达水平显著高于健康对照。研究发现变异亨廷顿蛋白显著增强CHOP上游转录调控因子，活化转录因子4（ATF4），与CHOP启动子特异性DNA序列相互结合，可能是变异亨廷顿蛋白影响CHOP转录水平的分子机制。同时发现变异亨廷顿蛋白影响内源性CHOP蛋白亚细胞分布，使其大量聚集在细胞核内，同时显著增加内源性CHOP蛋白的磷酸化水平。作为重要的应激诱导的转录因子，其细胞核内积聚和磷酸化水平增高会影响其转录活性及下游靶基因的表达。因此，通过变异亨廷顿蛋白引起ATF4-CHOP通路的失衡可能导致转录调节异常在多聚谷氨酰胺疾病的分子发病机制中起重要作用。干预ATF4-CHOP通路可能对多聚谷氨酰胺疾病的转录调节异常起重要作用。