旋毛虫抗肿瘤蛋白基因及其功能研究

旋毛虫包囊形成过程中寄生基因产生的寄生蛋白通过模拟宿主肌细胞凋亡调控下的细胞修复机制形成"nurse cell"，这种调控机制同肿瘤细胞的凋亡信号调控机制极其相似。我们的研究证实旋毛虫虫体蛋白中存在调控肿瘤细胞凋亡的活性蛋白，且该蛋白通过线粒体和死亡受体凋亡途径参与调控人白血病细胞系K562、人肝癌细胞系H7402的凋亡。为获得该蛋白的全基因序列，本研究利用已建立的旋毛虫成虫和新生幼虫的T7噬菌体展示文库，采用Giordan的有机相多细胞淘选法筛选与K562、H7402特异结合的目的蛋白，利用旋毛虫cDNA文库为模板钓取其全长序列，通过构建原核表达载体表达目的蛋白，采用Ni-NTA His. Bind离子交换树脂纯化融合蛋白，复性后检测其诱导肿瘤细胞凋亡及抗肿瘤功能，为研发可恢复肿瘤细胞的凋亡程序，增加肿瘤细胞对化疗及放疗的敏感性，并具有自主知识产权的抗肿瘤药物奠定基础。

本研究成功构建了旋毛虫T7噬菌体cDNA展示文库，利用该文库采用有机相多细胞亲和淘选法筛选出和人白血病细胞系K562、人肝癌细胞系H7402特异结合的候选蛋白A200711（该蛋白分子量为16736.3，分子式为C765H1163N205O205S7，疏水性指数是84.04），在后续研究中以旋毛虫cDNA文库为模版，针对旋毛虫A200711基因序列设计特异性引物，通过PCR扩增目的片段并克隆至表达载体pET28a，将成功构建的重组表达质粒pET28a-A200711转化至大肠杆菌BL21（DE3）中，IPTG诱导表达，经Ni亲和层析柱纯化并柱上复性后得到重组蛋白，SDS-PAGE、 Western blotting检测表明旋毛虫A200711蛋白在重组菌中成功得到表达。纯化、复性后的不同浓度旋毛虫A200711蛋白能有效抑制人肝癌细胞系H7402的增殖，并存在“量效-时效”关系，对人正常肝细胞系H7702的增殖不存在具有统计学意义的影响。Annexin V-FITC法检结果显示增加蛋白剂量会增强其促凋亡的作用，且具有线性关系。细胞周期检测发现旋毛虫A200711蛋白作用H7402肝癌细胞后会使细胞周期发生改变，细胞周期被阻滞于S期，蛋白浓度较高时出现明显的sub-G1凋亡峰。建立了人肝癌细胞系H7402裸鼠皮下种植瘤模型，实体瘤研究表明旋毛虫A200711蛋白可以抑制肝癌细胞系H7402裸鼠皮下种植瘤的生长，和阳性对照抗肿瘤常用药物顺铂（DDP）相比，蛋白作用组对裸鼠的生理状况影响较小。本研究表明旋毛虫A200711蛋白在体内、体外均可抑制H7402细胞的增殖，诱导肿瘤细胞的凋亡，且对人正常肝细胞系H7702的生长无影响；与抗肿瘤常用药物顺铂相比，旋毛虫A200711蛋白具有副作用小、药效温和的特点，这为旋毛虫A200711蛋白成为抗肿瘤候选药物提供了一定的研究基础。本研究共发表SCI 论文6篇，核心论文2篇，英文国际会议论文（10篇），共培养博士研究生2名（已毕业），硕士研究生5名（其中3名已毕业）。待发表SCI 论文1篇。