基于CRISPR/Cas9瞬时表达技术研究独脚金内酯合成关键基因调控苹果砧木不定根发生的分子机制

The dwarf and close planting of apple trees is considered as the development trend of modern apple industry. However, the low rooting rate of dwarf apple rootstocks during cutting propagation has severely restricted the popularization of dwarf and close planting technology. Our previous results have shown that strigolactones play important roles in the rooting process of apple rootstocks. It is of great significance to study the mechanisms by which strigolactones regulate adventitious roots formation. Also, it is important to figure out whether genetic engineering can be used to reduce endogenous strigolactones levels in order to improve apple rooting efficiency. This study will knock out strigolactone biosynthesis genes (MpCCD7、MpCCD8a and MpCCD8b) of apple rootstock M26 (Malus pumila Mill.) by using CRISPR/Cas9 transient expression technology to produce non-transgenic apple rootstocks with enhanced rooting ability. Also, we will systematically reveal the effects of strigolactones on adventitious roots formation by using endogenous strigolactones levels measurement, microscopic observation，transcriptome analysis and other important techniques. This study will help to build a deeper understanding of apple adventitious rooting mechanisms. Additionally, it will provide a new strategy for applying CRISPR/Cas9 technology to germplasm resources innovation in the process of apple rootstock breeding.

矮化密植栽培是现代苹果产业的发展趋势。矮化砧木扦插生根率低严重制约了苹果矮化密植技术的普及。我们前期研究发现，独脚金内酯在苹果砧木扦插生根过程中具有重要作用。独角金内酯调控苹果砧木不定根发生的机制，以及能否利用基因工程手段调控内源独脚金内酯浓度获得易生根苹果砧木值得深入研究。本研究拟利用前期研发的CRISPR/Cas9瞬时表达技术敲除苹果砧木M26(Malus pumila Mill.)中独脚金内酯合成关键基因（MpCCD7、MpCCD8a 和 MpCCD8b），获得非转基因易生根砧木材料。在此基础上，研究还将利用内源独脚金内酯浓度测定、显微结构观察及基因表达分析等手段，系统揭示独角金内酯调控苹果砧木生根的机理。本研究不仅有助于深入解析苹果砧木生根的调控机制，同时也为CRISPR/Cas9技术在苹果砧木育种中创新种质资源提供了一项全新的策略，具有广泛的应用价值。

苹果砧木不定根的形成能力是限制扦插繁殖的主要因素，生产上常用的矮化砧木大多生根能力差，严重制约了我国苹果产业的发展。独脚金内酯是植物株型调控的关键激素，在不定根发生过程中的作用机制有待解析。本研究取得以下成果：1）首次证实独脚金内酯可以通过抑制根原基的形成抑制苹果不定根的发生。对不定根形成过程中四个关键时间点开展转录组测序并结合WGCNA分析揭示MdBRC1是独脚金内酯调控不定根发生的关键基因，并通过稳定转化实验证实MdBRC1能够抑制苹果不定根发生。由此，初步阐明了独脚金内酯通过MdBRC1调控苹果不定根发生的分子机制。 2）通过本项目的实施，在苹果中建立CRISPR瞬时表达技术体系，并成功敲除独脚金内酯合成关键基因MdCCD7，获得的突变体不定根发生能力显著增强。本研究不仅有助于深入解析独脚金内酯调控苹果砧木不定根发生的分子机制，同时也为生物技术改良砧木不定根发生能力探索了一条高效途径。