口蹄疫病毒调控CD59表达时响应蛋白的筛选与功能分析

The complement system plays a central role in both innate and adaptive immune defenses against infectious pathogens. This system can be activated by three distinct pathways known as the classical, alternative and mannose-binding lectin pathways. Activation of the complement system is tightly regulated by complement regulatory proteins (CRPs), which restrict host self-complement activation thereby preventing self-injury. CD59 is a key CRPs member since it controls the formation of the membrane attack complex (MAC) at the terminal stage of the complement activation cascades via all three activation pathways. The role of CD59 protein in the replication of FMDV or in the pathogenesis of a FMDV infection is an interesting issue that, as yet, has not been studied. We have observed that CD59 protein expression was significantly up-regulated on FMDV-infected BHK-21 cells, so screening which viral protein that be responsible to the observation will be carried out through transfecting single FMDV gene into BHK-21 cells respectively. After this, we will examine transcriptional activity of CD59 gene induced by the selected viral protein using dual luciferase reporter assay system, moreover, the transcription factor binding domain of CD59 promoter will be determined with PCR gene deletion mutagenesis. Then we will perform electrophoretic mobility shift assay to capture the host cellular protein that binds the CD59 promoter directly. Thus, our finding will decipher the mechanisms by which CD59 expression is up-regulated in the FMDV infection process. Research in this area will not only continue to contribute to our knowledge of FMDV pathogenesis, but will continue to provide insight into the regulation of immune responses, and lead to improved FMDV vaccine strategy.

在利用先天性免疫和适应性免疫抵御传染性病原时补体系统发挥着中心枢纽作用，补体活化严格受到补体调节蛋白的控制，这些调节蛋白通过限制补体的活化而保护自身免受损伤。CD59是补体调节蛋白中的重要一员，它可以阻止攻膜复合物的形成，是作用于补体活化最后阶段的抑制性蛋白。CD59在FMDV复制和致病机理中的作用是个有趣的科学问题，但是至今还未被研究。 我们前期的结果显示FMDV感染BHK-21细胞可引起CD59的表达量显著上调，因此，通过分别转染单个病毒蛋白表达质粒的方法筛选能够提高CD59表达量的FMDV蛋白，然后利用双萤光素酶报告系统和PCR基因突变技术鉴定出CD59蛋白上游的转录子结合区，最终通过凝胶迁移滞后实验捕获与CD59启动子直接结合的宿主蛋白。这些结果将会解析FMDV感染时CD59表达量上调的分子机理，增强对FMDV致病机制及其调节免疫应答的认知，同时为改进FMDV疫苗效果提供策略。

CD59是补体调节蛋白中的重要一员，它可以阻止攻膜复合物的形成，是作用于补体活化最后阶段的抑制性蛋白。在项目实施过程中我们发现BHK-21细胞敲降或者过表达CD59蛋白后再感染口蹄疫病毒（FMDV），处理组病毒滴度与对照组相比均无显著的变化。因此，我们用传染性支气管炎病毒(IBV)替换FMDV作为研究载体，探索了CD59蛋白与IBV之间的相互作用关系。结果显示，IBV感染细胞后CD59蛋白的表达量显著下降，分析纯化的IBV病毒粒子时我们首次发现了CD59蛋白能够关联到IBV病毒颗粒上，进一步地我们挖掘了这一现象的生物学意义，CD59蛋白与IBV病毒颗粒的关联可以保护IBV免受抗体依赖的补体介导的裂解作用。此外，CD59蛋白过表达后IBV感染的细胞上清中IBV滴度显著地上升，CD59蛋白敲降或者蛋白酶切除细胞表面的CD59蛋白时，IBV再感染细胞后发现培养液上清中IBV滴度显著地下降。同时，这些处理组细胞内病毒N蛋白和基因组RNA与对照组相比没有显著变化，这说明CD59蛋白参与了IBV释放这一过程，而不是胞内的病毒蛋白表达和基因组复制。简而言之，IBV可以利用CD59蛋白来逃避宿主补体系统的破坏。.与此同时，我们也没有放弃FMDV分子致病机制的研究，在筛选FMDV与宿主蛋白相互作用的过程中，我们发现FMDV感染后BAG3蛋白（细胞自噬相关蛋白）出现显著的下调。过表达BAG3蛋白能够显著抑制FMDV复制，敲降BAG3蛋白能够显著促进FMDV复制。进一步地研究发现，FMDV L蛋白和2B蛋白可以显著降低BAG3蛋白的表达量。BAG3蛋白的降解主要由蛋白酶体途径来完成。我们利用CRISPR-CAS9技术构建了BAG3基因敲除BHK-21细胞株，这一细胞株感染FMDV后病毒滴度显著高于未敲除细胞株。因此，该细胞株有望作为生产FMD疫苗的种子细胞株。