基于MAPK通路的香菇菌丝体多糖抗胰岛β细胞氧化应激机制及调控胰岛素基因表达研究

The main reason of pancreatic β cell functional decline are apoptosis induced by oxidative stress and insulin gene expression decrease. Antioxidant separated from natural product guarantee pancreatic β cell normal function is current hot spot. The prophase experiment results showed that polysaccharide from cultured mycelia of Lentinus edodes can reduce pancreatic β cell ROS level and resist pancreatic β cell apoptosis induced by H2O2. In order to further study molecular mechanism of oxidative stress, pancreatic β cell oxidative stress induced with the addition of H2O2 and Glucose, imitate pancreatic β cell living environment with the condition of diabetes mellitus pathology. The protective molecular mechanism of polysaccharide on pancreatic β cell will be studied via p38MAPK and JNK signal pathway. Meanwhile, insulin gene promoter luciferase reporter gene plasmid will be structured. With the luciferase Assay, EMSA and CHIP technology, the activation of polysaccharide on insulin gene promoter will be assayed, the facilitation of polysaccharide on insulin secretion will be investigated, in order to identify signal transduction pathway of polysaccharide from cultured mycelia of Lentinus edodes protect pancreatic β cell from apoptosis induced by oxidative stress, clarify insulin gene expressive molecular mechanism promoted by polysaccharide from cultured mycelia of Lentinus edodes.

氧化应激导致的胰岛β细胞凋亡和胰岛素基因表达下降是胰岛β细胞功能减退的主要原因。从天然产物中分离抗氧化物质，保证胰岛β细胞正常功能是当前研究热点。前期实验结果显示香菇菌丝体多糖能够降低胰岛细胞的活性氧水平，抵抗过氧化氢诱导的胰岛β细胞凋亡。为进一步研究其抗氧化应激分子机制，本研究通过施加过氧化氢、葡萄糖诱发胰岛β细胞氧化应激，模拟糖尿病病理条件下的胰岛细胞生存环境，从凋亡信号通路p38MAPK和JNK角度研究香菇菌丝体多糖对胰岛β细胞的保护作用分子机制；同时构建胰岛素基因启动子荧光素酶报告基因质粒，利用双荧光素酶报告基因分析技术、EMSA和CHIP技术详细分析香菇菌丝体多糖对胰岛素基因启动子的激活作用，考察其对胰岛素分泌的促进作用；明确香菇菌丝体多糖保护胰岛β细胞免于氧化应激诱导细胞凋亡的信号转导途径，阐明香菇菌丝体多糖促进氧化应激状态下胰岛素基因表达的分子机制。

本研究利用H2O2作为诱导胰岛β细胞凋亡的氧化应激刺激因子，考察香菇菌丝体多糖抗氧化应激诱导的胰岛β细胞凋亡作用；利用葡萄糖模拟糖尿病病理条件下的氧化应激因素，研究香菇菌丝体多糖对胰岛β细胞的保护作用；基于凋亡信号通路p38MAPK角度，研究香菇菌丝体多糖对胰岛β细胞的抗氧化应激分子机制。结果表明香菇菌丝体多糖能够通过清除活性氧从而保护胰岛β细胞免于H2O2、高血糖等各种氧化应激诱导剂所导致的细胞凋亡，从而表现出广泛的胰岛β细胞保护作用。其确切的作用机制为香菇菌丝体多糖能够抑制H2O2和高糖活化的p38信号通路，降低H2O2和高糖引起的ASK-1、p38高磷酸化水平，从而抑制了氧化应激诱导的细胞凋亡。同时初步考察了香菇菌丝体多糖对氧化应激条件下胰岛素基因启动子活性的影响及作用机制，阐明了氧化应激和高糖能够降低胰岛素启动子活性，而香菇菌丝体多糖能够增强该启动子的活性。进一步分析表明，香菇菌丝体多糖能够促进胰岛素基因关键转录因子之一——PDX-1的表达和核转位作用，这是香菇菌丝体多糖促进胰岛素表达的可能机制。本课题的初步结论对日后的深入研究奠定了良好基础。关于在动物体内确定和阐明香菇菌丝体多糖抑制胰岛细胞凋亡、促进胰岛素分泌是接下来进一步工作的重点。