耐硫葡萄汁酵母外源基因渗入菌株A9的SSU1和FZF1基因功能分析

Saccharomyces uvarum is one of the most important yeasts for fruit wine making. However, sulfite tolerance of most Saccharomyces uvarum strains is sort of inferior among the wine yeasts, and the mechanism of sulfite tolerance is not clear yet. In previous studies, our research group got a high sulfur-resistant Saccharomyces uvarum introgression strain A9, and found that there was one inserted fragment in the SSU1 and FZF1 genes respectively, and the FZF1 gene was derived from Saccharomyces eubayanus. The results of cDNA-AFLP analysis and screening library of transgenic mutation by inserting T-DNA indicated that sulfur tolerance of A9 was significantly related with SSU1 and FZF1 genes. This study proposes using transgenic technology, gene insertion inactivation technology, mRNA differences analysis and high throughput sequencing analysis and so on to confirm the reasons of highly sulfur tolerance of A9 strain, proving the rationality and objectivity of "insert activation" hypothesis, but also to inspect the changes in the sulfur metabolism regulation network, under the circumstances like the SSU1 or FZF1 genes over-expressing or insert inactivation by T-DNA or be replaced, and then to determine these two genes' function of the strain. The results of the study will help to provide theoretical foundation for elucidating molecular mechanism of sulfite resistance and sulfite resistance breeding of Saccharomyces uvarum, and getting the SSU1 or FZF1 gene expression vector which can be directly used will lay the foundation to get new transgenic sulfur-resistant strains.

葡萄汁酵母是重要的果酒酿造酵母之一，但大多数菌株存在耐硫性较差的缺陷，且其耐硫分子机理尚不清楚。在前期研究中，课题组获得了一个高耐硫葡萄汁酵母外源基因渗入菌株A9，并发现了该菌株耐硫候选基因SSU1和FZF1中分别存在插入片段，且FZF1源于贝优酵母；cDNA-AFLP分析和转基因插入T-DNA的突变子库筛选结果表明SSU1和FZF1基因与耐硫性显著相关。本项目将用转基因、基因插入失活、mRNA差异显示分析和高通量测序分析等确证A9菌株具高耐硫性的原因，求证"插入激活"假说的合理性和客观性，同时考察在SSU1或FZF1基因过量表达或被T-DNA插入失活或被替换等情况下，硫代谢调控网络出现的变化，进而明确该菌株中这两个基因的功能。研究结果将为阐明葡萄汁酵母耐硫分子机理及其耐硫育种提供理论基础，得到可直接利用的SSU1及FZF1基因表达载体，则为获得新的葡萄汁酵母耐硫基因工程菌株打下基础。

葡萄汁酵母（Saccharomyces uvarum）是一种可用于果酒酿造的酵母，由于能产生特殊的风味及在低温下可发酵，而具有广阔的应用前景。然而，在大多果酒酿造时需加入一定量的二氧化硫或亚硫酸，而该菌种的大多数菌株耐硫性很差，是限制其进一步应用的重要缺陷。为此，我们对葡萄汁酵母耐硫的关键基因SSU1和FZF1进行了功能研究。为分析SSU1基因的功能，该课题组构建了两个含有不同SSU1基因的表达载体，并将其转入耐硫的葡萄汁酵母菌株A9。结果表明：基因组中额外的SSU1基因拷贝可以提升葡萄汁酵母的耐硫能力；在上游位置有插入片段的SSU1基因等位基因的过量表达，也可以影响葡萄汁酵母其它基因的表达及它的硫耐受能力。为评估FZF1的功能，我们构建了两个含有不同FZF1基因的过表达载体和一个FZF1沉默载体，并使用电将其导入到耐亚硫酸盐的葡萄汁酵母菌株中。此外，我们还构建了FZF1敲除菌株。FZF1过表达菌株均表现出对亚硫酸盐的耐受性升高，FZF1敲除株则显示出相反的效果，但FZF1转录抑制失败，这可能是由于DCR1和AGO的等位基因缺失所致。qRT-PCR分析被用于检测菌株中转录的变化。令人惊奇的是，FZF1过表达菌株并不促进SSU1转录，尽管Met4和Hal4转录本在亚硫酸氢盐耐受性增加的菌株中显著增加。我们认为，与酿酒酵母相比，FZF1在葡萄汁酵母菌株的硫耐受性中起着不同的作用。该项目是第一个有关葡萄汁酵母这一物种的基因工程研究，这在科学研究与实践上具有重要的意义。同时这也是第一个有关葡萄汁酵母SSU1和FZF1基因功能分析的研究，而在SSU1基因前的插入片段可提升它的功能也是首次被发现。SSU1基因的研究成果在Wiley出版社旗下的酵母研究领域顶级刊物FEMS Yeast Research发表。FZF1基因的研究成果则发表在South African Journal of Enology and Viticulture及 Frontiers in Microbiology(已接收）该项目的完成，为进一步培育葡萄汁酵母新菌株打下了理论基础，并为后续开发具有不同风味的不同水果的新型果酒打下了良好的基础，也为将来特色农业深加工的发展打下了基础。