ERKs和p38在中华绒螯蟹精子获能和顶体反应中的调节作用

Capacitation and acrosome reaction is the essential physiological prerequisite of fertilization. It is well established that cAMP/PKA signal pathway drive the tyrosine phosphorylation events associated with capacitation. Recent study indicated that surface phosphotyrosine expression is primarily driven by the extracellular signal-regulated kinase (ERK) module of the mitogen-activated protein kinase (MAPK) pathway.Thus the function of MAPK module in sperm capacitation and acrosome reaction become a new research hot point in reproduction. Sperm of Chinese mitten crab (Eriocheir sinensis) is multi-sperm interaction with one spawn but monospermy ultimately, sperm adheren spawn in vivo but fertiliztion in vitro. The special character of sperm in mitten crab had been studied extensivly using morphological,physiological and biochemical method, but the molecular research is deficiency and limited. We based on the transcriptome of testis from E. sinensis identified many MAPK members, including ERK,PAK,MEK1/2,p38,C-JNK et al.,that intrest us to study the function of MAPK signal pathway in sperm capacitation and acrosome reaction in E. sinensis. We will use the well-established research system on MAPK pathway in mammal, such as the general anti-ERK,anti-p38 antibody and all kinds of activators and inhibitors. Applying RACE,Western Blotting and immunolocalization methods to analysis the regulation mechanism of ERKs and p38 in capacitation and acrosome reaction in E.sinensis, that will accumulate molecular evidence to elucidate the mechnism of male reproduction of Chinese mitten crab.

获能是精子发生顶体反应和保障受精过程顺利完成的重要生理前提。普遍认为获能过程由cAMP/PKA信号级联通路调节,而最新研究发现ERK和p38家族参与调节精子获能过程中蛋白酪氨酸磷酸化水平，由此引发MAPK在精子获能和顶体反应研究中的新热点。中华绒螯蟹精子多精着卵、单精受精，以及体内着精、体外受精的生殖特点在形态、生理、生化方面已有研究，但在分子水平积累非常有限。基于中华绒螯蟹精巢转录组数据，从中发现ERK、p38、JNK等重要MAPK通路关键因子在性腺成熟阶段精巢组织中表达水平较高，由此引起我们对MAPK与雄性生殖相关功能的研究兴趣。利用模式生物成熟的MAPK信号通路研究体系，包括ERK、p38通用抗体和上下游关键元件专一性激活剂、抑制剂处理精子，应用Western印迹和免疫荧光共聚焦显微分析等实验方法研究其在中华绒螯蟹精子获能和顶体反应中的作用，为阐明河蟹雄性生殖机理积累分子水平的证据。

在本项目资助下，我们系统的开展了MAPK信号通路级联调控网络中至关重要的基因ERK 、p38、JNK以及JIP4在中华绒螯蟹雄性生殖中的重要调节作用，从基因、蛋白层面分别研究了这些基因的分布特征，在此基础上对其分布特征对应的功能进行深入的分析，在精巢发育的不同阶段分析这些基因和蛋白的表达水平和分布特点，进而探讨它们可能参与精巢发育以及精子发生的调控作用，进而发现这些基因或蛋白主要分布在精子中发挥作用，这样证实我们关注的MAPK信号通路级联调控网络确实在精子功能调节中发挥重要的作用。随后我们聚焦在精子中开展上述关键因子的动态分布分析，利用我们首次建立的中华绒螯蟹精子细胞体外培养系统开展活体精子诱导实验，利用我们初步建立的河蟹精子体外诱导顶体反应实验体系，观察精子顶体反应过程中这些关键因子的分布特征和重新分布趋势变化，由此直观的推断和分析它们具体参与精子顶体反应过程中的调节作用，初步建立了MAPK信号通路级联调控网络在中华绒螯蟹精子顶体反应过程中的调节作用模式图，勾勒出信号通路调节水平的大概框架图，为进一步深入探究网络之间的相互作用奠定了基础。本项目以非模式生物中华绒螯蟹为研究对象开展工作，填补了中华绒螯蟹雄性生殖研究方面的很多空白，首先建立了中华绒螯蟹精子细胞体外培养系统，初步建立了河蟹精子体外诱导顶体反应实验体系，首次尝试从信号通路角度理解河蟹精子功能调节机制，做了很多在中华绒螯蟹生殖研究领域的尝试性、开拓性工作，为繁荣该领域研究内容、激活创新研究思路、拓展研究方法等方面都起到积极的开拓作用。. 我们圆满完成了项目申请书中承诺的预期目标，项目申请书中承诺发表3-5篇SCI 论文，而我们目前已经发表10篇SCI 论文，后续还有相关论文在审稿或待投稿状态，因此，我们保质保量超额完成了项目书预期的成果目标。本项目执行期培养三位硕士生和两位硕博连读生，其中两位硕士生孙文娟和朱明已于2015年6月顺利毕业，在学期间发表发表SCI 论文各1篇；另一位硕士生杨洪丹将于2016年6月毕业；另外两位硕博连读生李青发表4篇SCI 论文，后续还有2篇整理待投的文章，王元丽已发表SCI 论文3篇，她们因工作努力、成果突出分别于2014年和2015年申请获得研究生国家奖学金各三万元的奖励，目前王元丽在留学基金委资助下赴美国哈佛大学访问学习一年，待学成归来将于2016年申请答辩并继续出国深造。